摘  要：本文主要研究了蜡样芽孢杆菌在高温杀菌产品、生产用水及生产环境的污染状况。肉中所含有的蜡样芽孢杆菌的数量比蔬菜类产品高。余氯对水中蜡样芽孢杆菌有一定的控制作用。

关键词：高温杀菌；蜡样芽孢杆菌；污染；控制

蜡样芽孢杆菌是需氧性、有运动性、能产生芽孢的革兰氏阳性大杆菌。蜡样芽孢杆菌常在下列产品中存在，如乳、肉、蔬菜、甜点心、调味汁、凉拌菜、炒饭等。往往因不加热或加热不完全引起食物中毒。针对我公司对日出口高温杀菌产品中出现的腐败现象，经反复检测、试验，确定引起产品腐败变质的微生物为蜡样芽孢杆菌。本试验的目的为检测高温杀菌产品蜡样芽孢杆菌的污染现状与控制措施。

1  材料方法

1.1  设备和材料

吸管、培养箱、均质器、天平、菌落计数器、冰箱、微波炉、平皿、滤器、抽滤设备、无齿镊子。

1.2  培养基及试剂

NGKG寒天基础培地、NaCl、95％酒精、鸡蛋。

2  检测方法［1，2］

2.1  水中蜡样芽孢杆菌的检测方法

2.1.1  原理

用孔径为0.45mm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上培养，计数滤膜上的典型蜡样芽孢杆菌菌落总数。

2.1.2  检验步骤

过滤水样：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将1000ml水样（如水样含菌数较多可减少过滤水样量或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门在-50kPa下抽滤。

培养：水样滤完后抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分移放在表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入恒温箱内，35℃培养48h。

结果观察：菌落特征为：35℃培养18h后，观察菌落，形成直径3～5mm，有的约10mm大而扁平、灰白色、粗糙的菌落。菌落表面粗糙似有毛玻璃状或溶蜡状，边缘呈扩展状。另外，在菌落周围因卵磷脂作用而形成明显的白至淡粉色的沉淀环。根据菌株不同，也有卵黄反应稍弱不形成沉淀环的。即典型菌落应符合蜡样芽孢杆菌特征：中心菌落呈白色不规则状，即一般不呈光滑的圆形，不呈典型凸起状，而是扁平凸起；白色菌落外是淡粉色环；必须有卵黄反应（在集落周围形成因卵黄作用形成的明显的浑浊圈，根据菌株不同，也有卵黄反应稍弱，形成浅浑浊环的东西）。

计数方法：在规定的培养时间内，取出平板观察，计数。

2.2  产品和环境中蜡样芽孢杆菌的检测方法

2.2.1  原理

蜡样芽孢杆菌呈卵磷脂酶阳性，在卵黄培养基上形成菌落周围明显的沉淀环。另，本菌在多粘菌素B中呈自然耐性，利用这些特性，使用作为选择分离培养基的加卵黄的NGKG寒天培地。

2.2.2  实验操作

样品制备：以无菌操作称取25g样品于灭菌均质杯内，加入225ml灭菌0.85％盐水，均质拍打30s，制成1∶10的样品匀液。预想到菌落会多的情况，进行梯度稀释。

分离接种：用无菌吸管分别吸取各梯度稀释液0.1ml分注到2个表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上。

培养：迅速以L行玻璃棒将接种物涂布于培地表面，避免涂到平板边缘，将平板正置，直至接种物被培养基吸收，将平板翻转，35℃培养48h。

菌落观察：同上。

计数方法：在规定的培养时间内，取出平板观察，计数直径3～5mm，有时10mm的大扁平、灰白色、粗糙的集落。若吸取各梯度稀释液0.1m1分注到2个表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上，则每g (ml)食品中蜡样芽孢杆菌的总数=2个平板上的菌落数的算术平均值×相应的稀释倍数×10。

例：将检样10**-1稀释液各0.1ml涂布于2个NGKG寒天培地平板上，各生长蜡样芽孢菌20个，则1g样品中蜡样芽孢杆菌数为：

[(20+20)／2]×10×10**1=2.0×103个／g

2.3  污染的检测

2.3.1  产品中蜡样芽孢杆菌的检测方法（如上）

2.3.2  水中蜡样芽孢杆菌的检测方法为滤膜法[1]  使用测余氯的方法为比色法[2]。目的是研究自来水中的游离余氯对蜡样芽孢杆菌的影响。

2.4  杀灭研究

蜡样芽孢杆菌耐热，其37℃16h的肉汤培养物的D80值为10~15min；使肉汤中细菌(2.4×107/ml )转为阴性需100℃20min。其游离芽胞能耐受100℃30min，而干热灭菌需120℃60min才能杀死。蜡样芽胞杆菌在4℃、pH4.3、盐浓度18％的条件下仍能存活或生长。通过高温杀菌或适当的冷藏可以控制蜡样芽胞杆菌的增殖。且蜡样芽孢杆菌喜农作物，一般以芽孢的形式存在于食品中，在适宜的条件下繁殖旺盛的革兰氏有芽孢杆菌。

杀灭：100℃经20min菌体可被杀死(未产芽孢)。

3  结果与讨论

3.l  产品检测结果与讨论

产品检测包括原料(含加工后的)和装袋后未杀菌半成品。结果见表1。

表1  产品检测结果

　　   

　　　   五花肉 猪脖精肉 

　　   数量 824 66 75 472 106 211 526

　　   检出数量 93 5 7 25 4 56 0

　　   检出率％ 11.29 7.58 9.33 5.30 3.77 26.54 0.00

如表1中所示，肉包括五花肉、猪脖精肉；蔬菜中含有胡萝卜，总样品量为肉、蔬菜和半成品的总和。五花肉、猪脖精肉、胡萝卜(含漂烫后的原料)，其蜡样芽孢杆菌的检出率分别为7.58％，9.33％和3.77％，说明肉中所含有的蜡样芽孢杆菌的数量比较高，再根据肉类和蔬菜类的检出率相比，也同样验证了肉比蔬菜更容易繁殖蜡样芽孢杆菌。从原料到半成品，其检出率从8.51％和5.30％升到了半成品的26.54％，说明车间在从原料加工到半成品的过程中，蜡样芽孢杆菌是不断繁殖的。

3.2  水检测结果与讨论

食品加工车间的每一个工序几乎离不开水，而水是微生物生长繁殖的必备条件。车间用水来自周围山地，无污染，其水流通系统为：地下水—集成水塔—分支输送到车间；地下水经水泵抽到水塔内，加次氯酸钠消毒，然后输送到车间。根据水的流程模拟进行检测，其结果如下：

人工配制消毒水，按比例加次氯酸钠配制成消毒水，使用的水量为1L。对所配制的水放置一段时间以模仿水塔和水管终端水的余氯。试验如下：

 (1)对所配制的水样放置0.5～1h后测余氯和蜡样杆菌结果见表2。

表2  水检测结果

 水的余氯 放置0.5～1h后余氯 蜡样芽孢杆菌数

 （ppm） (ppm) (个／L)

 0.3 0.3 30

 0.5 0.5 18

 1.0 1.0 4

（2）对所配制的水样放置2h后测余氯和蜡样杆菌结果见表3。

表3  水样中的余氯和蜡样杆菌结果

 水的余氯 放置2h后余氯 蜡样芽孢杆菌数

 （ppm） (ppm) (个／L)

  0.45 0.3 24

 0.5 0.3 22

 1.0 0.9 3

（3）对所配制的水样放置３h后测余氯和蜡样杆菌结果见表４。

表4  水样中的余氯和蜡样杆菌结果

 水的余氯 放置3h后余氯 蜡样芽孢杆菌数

 （ppm） (ppm) (个／L)

 0.5 0.4 8

 0.8 0.5 4

 1 0.6 3

 1.5 1.0 1

 2 1.5 0

（4）由以上的试验结果分析可知，在水中添加次氯酸钠可减少自来水中蜡样芽孢杆菌的数量，在自来水中游离氯越高蜡样杆菌数量则越少，且杀菌效果随时间长短有关系，我们拿0.5ppm和1.0ppm自来水中的细菌数量进行比较，其杀菌效果见表5。

　　表5  水中蜡样芽孢杆菌数量比较

新取自来水中蜡样芽 

胞杆菌(个／L)

 新配制水余氯(ppm) 放置0.5～1h后蜡样 放置2h后蜡样芽胞 放置3h后蜡样芽胞

  芽胞杆菌(个／L) 杆菌(个／L) 杆菌(个／L)

　 0.5ppm 18 22 8

　 杀菌效果 42％ 61％ 78％

 1.０ppm 4 3 3

 杀菌效果 87％ 94％ 92％

由表5可知，余氯的浓度越高，杀菌时间越长，杀菌效果越好，其百分率越大。余氯为1.０ppm时，杀菌时间为2h时，其杀菌百分率为94％，基本上把蜡样芽孢杆菌杀死了。所以车间用水一般要加氯杀菌(消毒水)。根据产品的要求和客户的要求，制定适合的余氯浓度，并经常检测余氯的浓度，使其达到要求，并定期更换消毒水，保持其最佳杀菌效果。

3.3  环境检测结果与讨论

车间加工环境污染情况见表6 。

表6  车间环境污染情况

名称 空气沉降 工人 电子秤 金探机切片机 案面 刀、刀板 盒盆 蒸柜 水槽、模具等               

数量  50 54 15 15 30 7 34 3 42

蜡样芽胞杆菌 10 7 5 l 2 2 4 l 0

检出率％ 2.00 12.96 33.33 6.67 6.67 28.57 11.76 33.33 0

由以上结果可知蜡样芽胞杆菌在车间环境中广泛存在，除了水槽、模具等中没有检出，其余各处都有检出。

3.４  工厂控制

（1）在车间加工的环境中，其空气也含有蜡样芽胞杆菌，对车间加强空气环境的控制，车间在班后应开臭氧机，进行臭氧杀菌；改善车间布局，减少与外界空气的对流。

（2）由于余氯对水中蜡样芽胞杆菌有一定的抑作用，可以在不影响产品质量的情况下，适当增加余氯量。

 

作者：李  钧1，仪淑敏2，李远钊3，娄喜山1

 

参考文献

［1］生活饮用水卫生规范.36.2.

［2］生活饮用水卫生规范.38.2.