气相色谱法-质谱检测法
1 方法提要
根据方法进行验证修改后,并依据欧盟指令建立了质谱测定条件,将某些关键步骤进行细化。
本方法适用于水产品和畜、禽肉组织、肠衣中氯霉素残留确证检测。用乙酸乙酯提取,提取液用正己烷净化,硅烷化后用气相色谱配有负化学源的5973N质谱检测器检测。
2 实验室设备
2.1 仪器和设备
2.1.1 Agilent6890气相色谱仪:配有负化学源的5973N质谱检测器。
2.1.2 离心机:5810型,Eppendorf公司。
2.1.3 均质器:T25型,18G 刀,IKA公司
2.1.4 旋转蒸发器:R-200,BUCHI公司。
2.1.5 移液枪:200μL、1000μL、5000μL,Eppendorf公司。
2.1.6 具塞塑料离心管:15 mL 、50 ML。
2.1.7 涡流混匀器:39760型,Thermolyne公司。
2.2 试剂
所有试剂均为分析纯级(有机试剂需重蒸馏),水为去离子水。
2.2.1 乙酸乙酯。
2.2.2 甲醇。
2.2.3 正己烷。
2.2.4 氯化钠。
2.2.5 无水硫酸钠:经650℃灼烧4 h,置于干燥器内备用。
2.2.6 硅烷化试剂: Sylon BFT {99% N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS){美国 Supelco产品,货号33154-u,0.1mL/ampul}。
2.3 标准物质
2.3.1 氯霉素(chloramphenicol):纯度≥99%,Amresco分装,上海生工生物工程有限公司和Sigma公司。
2.4 标准溶液的配制
2.4.1 标准储备液的配制
准确称取氯霉素标样50mg置50ml棕色容量瓶中,用甲醇溶解,并定容至刻度,混匀,浓度为1 mg/mL,4℃保存6个月。
2.4.2 标准工作溶液配制:
取1mL储备液用甲醇溶解定容到100Ml,此时浓度为1μg/mL,取1μg/mL 1mL定容至10mL,浓度为0.1μg/mL;取1μg/mL 0.5 mL定容至10mL,浓度为0.05μg/mL。
3 实验方法
3.1 试样制备
从所取原始样品中取出部分有代表性样品,经充分混匀。用四分法缩分出不少于500 g试样,混匀,均分成两份。装入清洁容器内,加封后,表明标记。
3.2 测定步骤
3.2.1 提取与净化
称取5 g(精确至0.01 g)试样于50 mL离心管中。加入25 mL乙酸乙酯,用均质器均质提取2 min,4000 r/min离心3 min。将乙酸乙酯层移入50 mL鸡心瓶中,试样再加入5 mL乙酸乙酯,涡流混匀器混匀1min,合并乙酸乙酯提取液,于40℃旋转蒸发至近干。
加入1 mL甲醇溶解残渣,再加入20 mL 4% 氯化钠溶液和15 mL正己烷,用涡流混匀器混合1 min,4000 r/min离心3 min。弃去正己烷层,水层加15 mL正己烷,同上操作,弃去正己烷层。水层中加入15 mL乙酸乙酯,用涡流混匀器混合2 min,3000 r/min离心3min。吸取乙酸乙酯层,通过无水硫酸钠柱(5g)脱水于另一个50 mL鸡心瓶中,用少量乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱。于40 ℃旋转蒸发至约1 mL。
3.2.2 衍生化
将浓缩液移入5 mL离心管中,用1 mL乙酸乙酯洗涤鸡心瓶,合并乙酸乙酯。于40℃吹氮气蒸发至干。加入100 µL正己烷和100 µL硅烷化试剂,于70℃烘箱中加热30min。吹氮气蒸发至干,加入0.50 mL正己烷与环己烷混合液(6:4),混匀溶解,供气相色谱测定。
3.2.3 测定
3.2.3.1 气相色谱条件
a) 色谱柱:30 m × 0.25 mm × 0.25 µm,HP-5MS;
c) PTV进样口温度:70℃(1.0 min)700℃/min 250℃(6.0 min) 700℃/min 300℃;
d) 载气:氦气,恒压模式,柱头压 10psi;
e) 进样量:2uL
3.2.3.2 质谱条件
a) 传输线温度:280°C
b) 溶剂延迟: 5min
c) 离子源温度:150°C
d) 四极杆温度:100°C
e) 反应气:甲烷,流量:2ml/min
f) 选择离子监测
目标物 监测离子
氯霉素 466,468,470,376
其中定量离子为466,定性离子为468,470,376
g) 离子停留时间:60毫秒
3.2.3.3 标准溶液的衍生化
取适量标准溶液,用氮气吹干,加入200 µL正己烷和100 µL硅烷化试剂,于80℃烘箱中加热30min。吹氮气蒸发至干,加入0.50 mL正己烷与环己烷混合液(6:4),混匀溶解,供气相色谱-质谱测定。在上述色谱条件下:氯霉素保留时间为 11.65 min。
3.2.3.4 样品测定
分别注射等体积的标准工作液、试剂空白、阴性控制样品、待检样品(不超过10个)、阴性控制和阳性控制样品,按上述色谱条件测定,峰面积定量。
4、气相色谱-质谱定性
(1)保留时间定性:在上述条件下,目标化合物的保留时间为11.65±0.1min
(2)质谱确证
在保留时间窗口内出现色谱峰后,获取其质谱图,扣除本底后如果以下判别标准全部符合,则可判定氯霉素存在:
所有4个监测离子全部在质谱图中出现
离子466为基峰和定量离子,其它3个离子与基峰丰度之比应符合如下标准
质荷比 标准丰度比(%) 允许相对偏离范围(%)
468 76 ±20
470 18 ±30
376 20 ±25
5、质量控制
每组实验除标准、样品,需同时进行溶剂空白实验、阴性控制样品实验和阳性控制样品实验。
5.1 溶剂空白
不加试样,用与样品相同的方法进行处理。
5.2 阴性控制样品
称取5.0克阴性控制样品,置于50 mL离心管中,用与样品相同的方法进行处理。
5.3 阳性控制样品
称取5.0克阴性控制样品,置于50 mL离心管中,用微量注射器加入0.1µg/mL的氯霉素标准工作液25 µL,相当于样品浓度0.5ng/g用与样品相同的方法进行处理。用相同浓度的标准进行定量,计算回收率,用来判断本组操作的可靠性。
6 结果计算
6.1 外标法定量
用色谱数据处理机或按下列公式计算:
式中:X—— 试样中氯霉素药物残留含量,mg/kg;
A—— 样液中硅烷化氯霉素色谱峰面积;
AS——标准工作溶液中硅烷化氯霉素色谱峰面积;
c—— 标准工作溶液中氯霉素的浓度,µg/mL;
V—— 最终样液的定容体积,mL;
m—— 最终样液所代表试样量,g。
计算结果需扣除空白值。
7 测定低限
本方法氯霉素的测定低限为 0.2 µg/kg.
8 可接受的检验结果
在添加浓度0.5μg/kg时,回收率,50%~120%。
9 检测报告
按照SPSBA00024检验报告管理程序执行。
10 方法验证
10.1 取相当于1μg/g的氯霉素衍生化物,在200-600M/z范围,进行全扫描分析,确定定量离了和确证离子及其丰度比,见附录1。
10.2 标准工作曲线
用注射器分别移取0.05µg/mL ,20µL 、30µL、60µL;0.1µg/mL,50µL, 1µg/mL, 25µL、标准工作液置于6个5ML 离心管中,氮气吹干,其系列分别相当于样品中0.2、0.3、0.4、1、5 ng/g的浓度。
分别注射等体积的标准工作液按给定的色谱条件进行测定,用GC-NCI-MS测定。记录峰面积,以峰面积为纵坐标,目标化合物浓度为横坐标,绘制标准工作曲线,计算线性关系,得到相关系数,结果见附录2。
10.3 回收率实验和室内精密度实验
以阴性控制样品为测试样品,添加水平分别为0.2μg/kg,0.3μg/kg, 0.4μg/kg,做6个平行样,共做三次,用对应工作曲线计算每个样品的浓度,并计算回收率、标准偏差和变异系数。
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