SN 0184-93 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法
Method for the examination of Listeria monocytogenes in food for export
样品：冷冻样品，2－5℃解冻，不超过18h
若不能及时检验，应置于－15 ℃保存。
非冷冻易腐样品应尽可能及时检验。
若不能及时检验，应置于4 ℃冰箱保存，在24h之内检验。
两次增菌：
巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品、冻肉及其它加工食品应该前增菌。
25g＋225ml改良缓冲蛋白胨水，均质。
30 ℃培养18－24h，移取1ml接种于100ml增菌培养液（EB)中，30 ℃培养24、48h，分别进行分离。
直接增菌：
生乳、鲜肉以及未经加工处理过的样品。
25g＋225ml 增菌培养液，30 ℃培养24和48h，分别进行分离
分离：
划线接种于MMA或者OXA平板，35 ℃培养24－48h。
斜射光镜检。
MMA平板：蓝色或者兰灰色,扁平圆润，稍有凸起,边缘整齐 ，菌落较小，约为0.5mm左右
OXA平板： 菌落呈黑色，直径1mm，在其周围形成一个黑色环。
从MMA或OXA上挑取5个可疑菌落，接种TSA-YE平板，进行纯培养。
纯化菌落再转接到TSB-YE肉汤，35℃培养24h。
进行生化试验。
典型运动镜检：
从TSA-YE平板挑取生长良好的菌落于洁净载玻片上。
用0.85%灭菌生理盐水制成悬浮液。
在显微镜下用油镜观察。
短棒状杆菌，显微镜下可见轻微旋转和翻滚。
过氧化氢酶：
过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解成水和氧。
菌落－平板－1滴3％的过氧化氢。阳性。过氧化氢酶实验也可以在试管中进行。
革兰氏染色镜检： 革兰氏阳性
溶血试验：
7％羊血琼脂平板，划分小格，刺种菌落。做阳性对照和阴性对照（英诺克李斯特氏菌）。
35 ℃培养24－48h，于明亮处观察。
单核细胞增生李斯特氏菌在刺种点产生窄小的透明β溶血环。
尿素酶（Urease）试验：
有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。
穿刺接种尿素酶琼脂斜面，35℃培养5天，逐日观察，阴性。
硝酸盐还原试验：
某些细菌能够把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐。
亚硝酸盐与乙酸反应生成亚硝酸。
硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸。
偶氮苯磺酸与α萘氨结合，形成红色的N－α苯氨偶氮苯磺酸
接种硝酸盐肉汤，35℃培养5天，
加入0.2ml试剂A，再加入 0.2ml试剂B，轻摇混合。
红色：阳性
没有颜色变化：加入少量锌粉
－变红－阴性（硝酸盐未被还原）
－不变－阳性（亚硝酸盐已经分解成氨和氮）
三糖铁（TSI）琼脂试验：
本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。
三糖铁试验：
接种三糖铁琼脂，35℃培养5天。
斜面和底层产酸，不产生硫化氢。(发酵葡萄糖和蔗糖）
糖酵解试验：
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。
接种0.5%糖类发酵管。
35℃培养24－48h，阴性继续培养到5天。李斯特氏菌不产气。
葡萄糖：阳性
麦芽糖：阳性
七叶苷：阳性
甘露醇：阴性
鼠李糖：阳性
木糖：阴性
动力观察：
穿刺接种半固体动力培养基，
室温（20－25℃）培养2－5天，逐日观察。
有动力。
自穿刺线向四周蔓延生长，
呈典型伞状生长，底部为弯月牙状。
协同凝血试验：企业可不做。
血清学检验：企业可不做。
小鼠毒力试验：企业可不做。
结果报告：
阳性结果：检出单核细胞增生李斯特氏菌
阴性结果：未检出单核细胞增生李斯特氏菌
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