【摘要】  目的 在大肠杆菌中诱导表达以嗜酸乳杆菌克隆β半乳糖苷酶基因lacZ，为研究其酶学特性做准备。方法 从嗜酸乳杆菌ATCC 4356中克隆lacZ基因，并构建表达载体pET22blacZH、pQE31HlacZ和pQE31lacZ，然后在大肠杆菌中诱导表达，并测定表达产物的β半乳糖苷酶活性。结果 无标签的重组嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶LacZ获得了功能性表达，表达量可达2.28 kU/L.而融合HisTag的重组嗜酸乳杆菌LacZ却失去了β半乳糖苷酶活性，即使复性也不能恢复。结论 克隆表达的成功为该酶的酶学性质研究和可能的应用打下了基础。

【关键词】  嗜酸乳杆菌； β半乳糖苷酶； 克隆表达； HisTag；复性

    【Abstract】  Objective To clone and express the lacZ gene of L. acidophilus in E. coli for research of the properties of the putative βgalactosidase. Methods  The lacZ gene was cloned from L. acidophilus ATCC 4356 and was inserted into three recombinant vectors: pET22blacZH, pQE31HlacZ and pQE31lacZ. The recombinant proteins were induced and were identified by SDSPAGE and βgalactosidase assay. Results The recombinant lacZ without tag was expressed as functional βgalactosidase, which yield was 2.28 kU/L, but the two recombinant LacZs with Histag were expressed as proteins without activity and its activity could not recovery by renaturation. Conclusion The study make a base for research of enzymatic properties and probable application in the future.

    【Key words】  Lactobacillus acidophilus;  βgalactosidase;  expression;  HisTag;  renaturation

    β-半乳糖苷酶(βgalactosidase，EC 3.2.1.23)因为能水解牛奶中的乳糖而广泛的应用于乳品工业［1,2］，又因为便利的显色反应而普遍应用于分子生物学研究［3,4］。寻找新的β半乳糖苷酶可以促进分子生物学研究和乳品工业发展。

    最近嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）NCFM菌株基因组DNA（GenBank accession No. CP000033)已完成测序［5］。该菌基因组携带有3个推定的β半乳糖苷酶编码基因：lacA、lacZ和lacLM。已知lacLM基因编码的β半乳糖苷酶是该菌降解乳糖的主要酶［6,7］，而lacZ基因却功能不明。迄今为止，还没有关于该基因编码产物的研究报道。嗜酸乳杆菌lacZ基因和著名的大肠杆菌（Escherichia coli）lacZ基因虽然同名，其序列却没有相似性。该基因相似于极端环境微生物的属于糖苷水解酶42家族（glycoside hydrolase family 42，GH42）的β半乳糖苷酶基因。极端环境微生物中的GH42 β半乳糖苷酶因耐热［8］、耐盐［9］、耐低温［10］或有特殊的底物而受到关注。嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶LacZ可能同极端环境微生物的GH42 β半乳糖苷酶一样，具有某种独特的性质，从而应用于分子生物学研究或乳品工业。

    本实验设计了3个克隆表达载体，试图在大肠杆菌中大量表达嗜酸乳杆菌GH42β半乳糖苷酶LacZ，旨在为后续的酶学性质研究提供依据。

    1  材料与方法

    1.1  菌株和质粒

    嗜酸乳杆菌ATCC 4356购自中科院微生物研究所菌种保藏库，培养条件为：在37 ℃下，于MRS培养液［6］中静置培养24～48 h.大肠杆菌JM109和Rosetta菌株是本实验室保存，培养条件为：在37 ℃下，于LB培养液中摇振培养过夜。选用本实验室保存的质粒pET22b和pQE31为表达载体。筛选条件为100 μg/ml的氨苄青霉素。

    1.2  嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶基因的PCR扩增

    嗜酸乳杆菌基因组DNA的提取方法参考文献［11］。用嗜酸乳杆菌ATCC 4356的基因组DNA为模板，加入下列引物扩增嗜酸乳杆菌lacZ基因： P1:5′CAGGATCCGATGACACAATTATCACG

    TTTTC3′；P2:5′GGCTCGAGATTTCTCAATA

    CTTGAACATCC3′；P3:5′GCCTGCAGCTAAT

    TTCTCAATACTTGAACATCC3′；P4:5′CCGA

    ATTCTAGAGGAAATAAAATGACACAATTA

    TCACG3′.P1和P2扩增的是不带终止密码子的lacZ基因的编码序列，扩增片段长2 018 bp；P1和P3扩增的是带有终止密码子的lacZ基因编码序列，扩增片段长2 021 bp；P4和P3扩增的是从lacZ的RBS到终止密码子之间的序列，扩增片段长2 033 bp.PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸130 s，共20个循环；最后72 ℃延伸10 min.凝胶电泳检测PCR结果，PCR纯化试剂盒回收目的条带。

    1.3  嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶表达载体构建

    分别用对应的内切酶对PCR产物和载体进行双酶切，胶回收后用T4DNA连接酶连接，再将连接产物电转化入宿主菌株。共构建3个重组质粒(见图1)：（a）是pET22blacZH，由P1和P2扩增的片断和pET22b连接构成，lacZ基因置于T7启动子控制下，5′端带有果胶酶信号肽序列，3′端带有HisTag.转化Rosetta菌株，以含氨苄青霉素的LB平板筛选。（b）是pQE31HlacZ，由P1和P3引物对扩增的片断和pQE31连接而成，lacZ基因置于T5启动子控制下，5′端带有HisTag.（c）是pQE31lacZ，由P4和P3引物对扩增的片断和pQE31连接而成，lacZ基因置于T5启动子控制下，自带RBS位点，5′端和3′端没有任何标签和多余序列。（b）和（c）转化JM109菌株，以含氨苄青霉素、XGal和IPTG的LB平板筛选。双酶切和PCR初步鉴定重组质粒，并送上海生工公司测序鉴定。

    1.4  重组嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶的诱导表达

    诱导方案为：诱导温度设为37 ℃、30 ℃、25 ℃和20 ℃；诱导剂IPTG浓度设为：0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L；培养基设为含0.5 %乳糖的LB培养基和普通LB培养基。120 r/min摇床培养重组菌株pET22blacZH/Rosetta、pQE31HlacZ/JM109和pQE31lacZ/JM109各10 ml，培养至OD600≈0.6，加IPTG诱导8 h.取3 ml表达菌液，6 000×g离心2 min收集菌体，再用300 μl ddH2O将菌体混悬均匀，在冰上用超声波破碎菌体，12 000×g离心30 min，收集上清液测定其β半乳糖苷酶比活力。重悬的超声沉淀、超声上清液和重悬的菌体一并做SDSPAGE分析。用Bradford法测定蛋白质浓度。

    1.5  重组β半乳糖苷酶的酶活性测定

    酶活性测定方法根据文献［12］修改：在200 μl反应液（22 mmol/L ONPG，50 mmol/L Na3PO4，pH 6.6）中加入10 μl适当稀释的试验样品，37 ℃温育10 min后，加入450 μl浓度为0.4 mol/L的Na2CO3溶液终止反应，于420 nm处测定OD值。设定在该反应条件下，每分钟释放1 μmol邻硝基苯酚为1个酶活单位（U）。

    1.6  包涵体表达的重组β半乳糖苷酶的提取和复性

    根据诱导表达实验结果，在37 ℃培养构建的3株重组菌株各500 ml，加终浓度为0.4 mmol/L的 IPTG诱导表达8 h，然后离心收集表达菌体，用buffer A（50 mmol/L Tris·Cl， 50 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，5 %甘油，pH 8.0）洗涤后，在冰浴中超声破菌。然后按照文献［13］的描述，用Triton X100提取和洗涤包涵体，再用尿素溶解包涵体。将包涵体溶解液在逐渐降低变性剂浓度的溶液中透析复性：透析液Ⅰ(2 mol/L尿素，20 mmol/L Tris·Cl，0.1 mmol/L GSSG，0.9 mmol/L GSH， pH 8.0)，透析液Ⅱ(0.5 mol/L尿素，20 mmol/L Tris·Cl，0.1 mmol/L GSSG，0.9 mmol/L GSH，pH 8.0)，透析液Ⅲ（50 mmol/L Tris·Cl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，70 μl/L β巯基乙醇，pH 8.0）。SDSPAGE电泳和β半乳糖苷酶活性测定检测效果。用Bradford法测定蛋白质浓度。

    2.1  嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶基因的表达载体

    以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板的3个PCR均得到了预期条带。酶切、连接和电转化后，均筛选到了转化子。其中pQE31lacZ/JM109的转化子在筛选平板上呈现为蓝色菌落；而pQE31Hlac Z/JM109的转化子在筛选平板上仍然呈现为白色菌落。这个现象提示pQE31lac Z/JM109菌株表达了有活性的重组β半乳糖苷酶，而pQE31Hlac菌株表达的重组β半乳糖苷酶可能没有活性。双酶切、PCR（见图2）及测序证实3种重组质粒pET22blacZH、pQE31HlacZ和pQE31lacZ均构建成功。测序表明克隆序列和嗜酸乳杆菌NCFM菌株lacZ序列100 %相同。序列提交GenBank，登录号为：EU590652.

    2.2  重组嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶的表达形式

    经检测，在各诱导条件下，菌株pET22blacZH/Rosetta的超声上清液的β半乳糖苷酶比活力和对照菌株（pET22b /Rosetta）超声上清液的β半乳糖苷酶比活力都没有显著区别，表明该重组菌株很可能不表达有活性的重组LacZ.SDSPAGE结果显示在全菌样品和超声沉淀样品中均存在一个显著的约70 kDa（接近嗜酸乳杆菌LacZ的理论分子量76 583 Da）的表达条带，但是在超声上清液中却没有明显的70 kDa表达条带（见图3B）。因此判定C端融合HisTag的重组LacZ的表达形式为包涵体表达。

    pQE31HlacZ/JM109在各诱导条件下的超声上清液中都测不到β半乳糖苷酶酶活，表明该重组菌株不能表达有活性的重组LacZ.SDSPAGE显示了和pET22blacZH/Rosetta相似的结果（见图3A），因此判定N端融合HisTag的重组LacZ的表达形式也为包涵体表达。

    pQE31lacZ/JM109在各诱导条件下均能在超声上清液中检测到β半乳糖苷酶酶活性，说明该菌株实现了无标签重组LacZ的可溶性表达。在诱导条件为25 ℃、0.4 mmol/L IPTG和含0.5 %乳糖的LB培养基时，超声上清液中β半乳糖苷酶活性最高，比活力达到1.14 U/mg。据此推算，诱导后菌液中的β半乳糖苷酶单位约为2.28 kU/L.SDSPAGE显示在超声上清液中有明显的表达条带（见图3D）。不过在37 ℃下却主要为包涵体表达，超声上清液中的表达条带减弱（见图3C）。相应的，超声上清液的β半乳糖苷酶比活力也下降到0.18 U/mg.

    2.3  包涵体表达的重组蛋白的复性

    C端标记LacZ经透析复性后，测得复性后的目标蛋白溶液的浓度为0.43 mg/ml.酶活性测定表明复性蛋白没有β半乳糖苷酶活性。N端标记LacZ经透析复性后，测得复性后的目标蛋白溶液的浓度为0.35 mg/ml.酶活性测定表明复性蛋白也没有β半乳糖苷酶活性。而无标签重组LacZ经透析复性后，测得复性后的目标蛋白溶液的浓度为1.16 mg/ml.酶活性测定表明复性蛋白溶液β半乳糖苷酶活性含量为10.1 U/ml，比活力为8.72 U/mg.

    3  讨论

    重组菌株pQE31lacZ/JM109在筛选板上长出蓝色菌落；诱导后，其超声上清液具有β半乳糖苷酶活性（1.14 U/mg，25 ℃），SDSPAGE图上显示了明显的重组嗜酸乳杆菌LacZ条带（70 kDa）；表达为包涵体的重组嗜酸乳杆菌LacZ也复性成功（8.72 U/mg）。这一组实验结果表明无标签的重组嗜酸乳杆菌LacZ实现了功能性表达。

    重组菌株pQE31HlacZ/JM109和pET22blacZH/Rosetta虽然都在SDSPAGE图上显示了明显的重组嗜酸乳杆菌LacZ条带（70 kDa），但是在超声上清液中却没有重组β半乳糖苷酶活性。这说明重组蛋白的表达形式是包涵体。在包涵体复性实验中，两种重组β半乳糖苷酶（HLacZ和LacZH）都不能测得酶活性。说明这两种重组β半乳糖苷酶都没能重折叠为有活性的构象。比较无标签重组LacZ的成功复性，作者推论，很可能是融合的HisTag阻碍了重组蛋白的正确折叠。利用NCBI网站的保守结构域检索工具进行检索，发现嗜酸乳杆菌LacZ的C端和N端均存在保守结构域，分别称为GH42 β半乳糖苷酶N端结构域和GH42 β半乳糖苷酶C端结构域。显然HisTag对这两个结构域的影响是复性失败的可能原因。

    重组质粒pQE31lacZ的克隆方式是独特的。该克隆方式可确保重组蛋白的氨基酸序列不会因克隆带上附加序列。如果只利用pQE31质粒多克隆位点(MCS)的酶切位点构建重组质粒，表达的重组蛋白的N端将带上有利于纯化的HisTag.但是HisTag有可能会影响重组蛋白的活性。如果利用pQE31质粒lacO与RBS之间的Eco R I酶切位点和MCS上的任意酶切位点构建重组质粒，就能切掉pQE31质粒的HisTag和RBS位点。在目标片段上带上RBS，表达的重组蛋白将没有任何附加的氨基酸残基，这就确保不会因克隆而导致重组蛋白不同于亲本蛋白。若为了研究蛋白的活性而进行的克隆，显然这个克隆策略最好。

    嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶LacZ和极端环境微生物的GH42 β半乳糖苷酶属于同一糖苷水解酶家族，很可能该酶像极端环境微生物的GH42 β半乳糖苷酶一样具有令人感兴趣的酶学特性。目前还没有该酶的克隆表达报道。本文设计了3个表达载体，表达了3种重组LacZ，分别为N端标记HisTag、C端标记HisTag和无标签的重组LacZ.其中无标签重组LacZ实现了功能性表达，为该酶的酶学性质研究和可能的应用打下了基础。

作者：潘渠  胡福泉  陈恬  邱岳  王广科  李晋川《成都医学院学报》

  ［1］ Bakken AP, Hill CG, Amundson CH, et al. Hydrolysis of Lactose in Skim Milk by Immobilized betagalactosidase (bacillus circulans) ［J］. Biotechnol Bioeng, 1992, 39(4):408417.

［2］ Chen W, Chen H, Xia Y, et al. Production, Purification, and Characterization of a Potential Thermostable Galactosidase for Milk Lactose Hydrolysis from Bacillus stearothermophilus［J］. J Dairy Sci, 2008, 91(5):1 7511 758.

［3］ Liu WF, Gao D, Wang ZN. Expression of the Extracellular Domain of the Human Immunodeficiency virus Type 1 Envelope Protein and Its Fusion with betagalactosidase in Saccharomyces cerevisiae［J］. Clin Diagn Lab Immunol, 1998, 5(4):592594.

［4］ Cannio R, de PD, Rossi M, et al. Gene Expression of a Thermostable betagalactosidase in Mammalian Cells and Its Application in Assays of Eukaryotic Promoter Activity ［J］. Biotechnol Appl Biochem, 1994, 19 ( Pt 2):233244.

 

［5］ Altermann E, Russell WM, AzcaratePeril MA , et al. Complete Genome Sequence of the Probiotic Lactic Acid Bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(11):3 9063 912.

［6］ Nguyen TH, Splechtna B, Krasteva S, et al. Characterization and Molecular Cloning of a Heterodimeric betagalactosidase from the Probiotic Strain Lactobacillus acidophilus R22 ［J］. FEMS Microbiol Lett, 2007, 269(1):136144.

［7］ W M Russell, T R Klaenhammer. Efficient System for Directed Integration into the Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus gasseri Chromosomes via Homologous Recombination ［J］. Appl Environ Microbiol, 2001, 67(9):4 3614 364.

［8］ Reyhan GulGuven, Kemal Guven, Annarita Poli, et al. Purification and Some Properties of a βgalactosidase from the Thermoacidophilic Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmannii Isolated from Antarctica ［J］. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(6):1 5701 577.

［9］ Holmes ML, DyallSmith ML. Sequence and Expression of a Halobacterial betagalactosidase Gene ［J］. Mol Microbiol, 2000, 36(1):114122.

［10］ Coombs JM, Brenchley JE. Biochemical and Phylogenetic Analyses of a Coldactive betagalactosidase from the Lactic Acid Bacterium Carnobacterium piscicola BA ［J］. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(12):5 4435 450.

［11］ 潘渠，李晋川，丛延广，等.嗜酸乳酸杆菌 ATCC 4356菌株异源二聚体β半乳糖苷酶的克隆表达 ［J］. 微生物学报, 2008, 48(10):1 3391 343.

［12］ Nguyen TH, Splechtna B, Yamabhai M, et al. Cloning and Expression of the betagalactosidase Genes from Lactobacillus reuteri in Escherichia coli ［J］. J Biotechnol, 2007, 129(4):581591.

［13］ J. 萨姆布鲁克,D. W. 拉塞尔. 分子克隆实验指南［M］.第3版.北京:科学出版社，2006：1 2561 260.