【摘要】  目的  应用细菌内同源重组高效制备p53基因重组腺病毒。方法  设计引物扩增p53基因，在上下游引物分别引入Xhol和HindⅢ酶切位点，将p53基因亚克隆连接到经相同酶切的p shuttle-cmv转移质粒上，转化DH5α筛选卡那霉素抗性菌落构建重组腺病毒转移质粒p shuttle-cmv-p53用Pmel酶切线性化采用两步法进行同源重组：先将腺病毒骨架质料pAdEasy-1转化氯化钙法制备的BJ5183感受态细菌，筛选得到链霉素和氨苄青霉素抗性的AdBJ5183转化菌；再将线性化的p shuttle-cmv-p53转化氯化钙法制备的AdBJ5183感受态细菌，在细菌内进行同源重组，挑选卡那霉素抗性菌落培养并提取质粒，琼脂糖电泳挑选大片断的重组质粒pAdBJ5183-P53分别用限制性内切酶PacI和BstXI及PCR法鉴定。结果  成功构建了p53基因重组腺病毒表达载体。结论  采用简化的两步氯化钙化学转化法可以取代电穿孔法高效构建重组腺病毒表达载体。

   

    【关键词】  腺病毒载体；同源重组；p53基因

   

    Construction of recombinant adenoviral vector carrying wt-p53 gene by simplified two-step homologous recombination in bacteria

   

    ZOU Chang-yong，QUANG Jia-wu，TIAN Sheng-he，et al.Wuhan Institute of Biological Products，Wuhan 430060，China

   

    【Abstract】  Objective  To construct recombinant replication-defective human adenovirus serotype 5 vector carrying wt-p53 gene by simplified two-step homologous recombination protocol in bacteria.Methods  wt-p53 gene was firstly subcloned into a transfer vector p shuttle-cmv and the positive recombinant p shuttle-p53 was linearized by PmeI.Then the simplified two-step homologous recombination protocol was employed for the construction of recombinant adenoviral vector.In step one，adenoviral skeletal plasmid pAdeasy-1 was transformed into BJ5183 competent cells by calcium chloride chemical methed to obtain pAdBJ5183;and in step two，linearized psh-p53 plasmid was transformed into pAdBJ5183.The possible positive adenoviral plasmids were selected by agarose gel electrophoresis and indentified by PacI as well as BxtXI cleaved pattern.Results  Replication-defective recombinatant adenovirus containing human p53 gene was successfully constructed.Conclusion  The results indicated that the calcium chloride chemically simplified two-step homologous recombination protocol can replace the co-transformation by electroperforation and may have broaed utility in system that involve homologous recombination in bacteria.

   

    【Key words】  adenoviral vector;homologous reombination;p53 gene

   

    复制缺陷型腺病毒可以高效介导基因的体内外转移；感染细胞范围广，不但可以感染分裂期细胞，也可感染静止期细胞；感染细胞时其DNA不整合到宿主细胞染色体中，安全可靠。因此成为基因治疗中常用的载体。重组腺病毒载体的构建方法有真核细胞内质粒重组法、酵母人工染色体克隆系统、Cre/loxp定点重组系统、末端蛋白-DNA复合物共转染法等［１～３］。以上方法牵涉到的步骤和环节较多、工作量大、实验周期长。1998年He等［4］建立了细菌内质粒共转化同源重组方法，该法简便快速、实验周期短，但是共转化需要电穿孔仪，且同源重组成功率不到20%。笔者在实际工作中对该法进行了改进，采用简化的两步氯化钙化学转化法代替电穿孔共转化法构建了p53重组腺病毒表达载体。

   

    1  材料与方法

   

    1.1  实验材料  pAdEasy-1、pshuttle-cmv质粒，BJ5183、

   

    DH5α大肠杆菌，PmeI酶购自Qbiogene公司；携带p53基因的质粒由马延高教授惠赠；PacI酶购自New England公司；PCR Premix、DL2000Marker购自TaKaPa公司；λDNA·HindⅢMarker购自Promega公司；其他分子生物学工具酶购自MBI公司。

   

    1.2  重组转移质粒的构建  设计扩增p53基因的上下游引物分别为：

   

    p53-up:5 atg tct cga gat gga gga gcc gca gtc aga 3 （30bp），

   

    p53-down:5 aag taa gct ttc agt ctg agt cag gcc ctt 3 （30bp），在上下游引物分别引入XhoI和HindⅢ酶切位点，由上海生工合成。采用上述引物以携带p53基因的质粒为模板进行PCR扩增p53基因片断。PCR参数为：94℃变性5min;94℃30s、56℃30s、72℃50s，共30个循环；72℃延伸10min。用XhoI和HindⅢ酶切PCR产物，琼脂糖凝胶电泳回收，连接到同样经XhoI和HindⅢ酶切回收的pshuttle-cmv转移质粒中；转化DH5α感受态菌，卡那霉素抗性平板筛选。

   

    1.3  重组转移质粒的鉴定  挑选卡那霉素抗性平板筛选菌落培养，碱裂解法提取质粒，用XhoI和HindⅢ酶切鉴定，并以能酶切出与目的基因片段大小相符的质粒为模板，用上述引物进行PCR鉴定。得到的重组转移质粒命名为psh-p53。再用上述引物由上海生工公司测定psh-p53中目的基因片段序列。

   

    1.4  两步法细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒

   

    1.4.1  step1:用氯化钙法制备BJ5183感受态细菌  将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1转化BJ5183感受态细菌，接种在链霉素和氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取菌落培养并抽提质粒，以pAdEasy-1为对照，用BstXI酶切鉴定，得到的阳性菌命名为AdBJ5183菌。

   

    1.4.2  step2:同源重组  用氯化钙制备AdBJ5183感受态细菌；将序列正确的重组转移质粒psh-p53用PmeI酶切线性化，不需灭活PmeI酶，也不需回收，直接取大约30ng酶切线性化质粒转化AdBJ5183感受态细菌，卡那霉素抗性平板筛选，挑取菌落培养并抽提质粒，0.8%琼脂糖电泳初筛分子量大于30kbp的质粒，以pAdEasy-1为对照，分别用PacI、BstXI酶切鉴定，对酶切图谱符合的质粒采用前述扩增目的的基因片段的引物进行PCR鉴定。得到的阳性菌命名为AdBJ5183-p53菌。相应的阳性重组腺病毒质粒为pAdBJ5183-p53。再将AdBJ5183P53转化DH5α得到pAdp53。

   

    2  结果

   

    2.1  重组转移质粒psh-P53的构建及鉴定

   

    （1）重组转移质粒psh-P53经XhoI和HindⅢ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳观察，出现一条约7.4kg的转移质粒带和一条约1.2kb的p53目的基因带，见图1。

   

    （2）以能酶切出与目的基因片段大小相符的质粒为模板，用扩增目的基因的引物进行PCR鉴定。可以得到约1.2kb大小的片断，见图2。

 

图1  重组转移质粒的酶切鉴定

Fig1  screening recombinant transfer vecter by XhoI and HindⅢ   lanel:DL2000Marker lane2～4：recombinant transfer vecter/XhoI and HindⅢ lane5～6：transfer vector/XhoI and HindⅢ as control

 

图2  重组转移质粒的PCR鉴定

Fiv2  screening recombinant transfer vecter by PCR lane1:negative control    lane2:positive control lane3:recombinant transfer vecter lane4:DL2000 marker

 

    （3）测序结果经Vector NTI软件分析正确。

    

    2.2  重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

   

    （1）将腺病毒骨架质粒转化BJ5183感受态菌，抽提链霉素和氨苄青霉素双抗性的质粒，对照骨架质粒pAdEasy-1，用BstXI酶切鉴定。pAdEasy-1质粒有6个BstXI酶切位点，可以产生6个片断。电泳结果显示，AdBJ5183质粒与pAdEasy-1图谱一致，见图3。

 

图3  pAdBJ5183质粒用BstXI酶切鉴定

padBJ5183 plasmids cleaved pattern by BstXI lane1:λDNA/HindⅢ Marker，lane2:pAdEasy-1，lane3:pAdEasy-1/BstXI，lane4:pAdBJ5183/BstXI

 

    （2）线性化的重组转移质粒psh-p53转化AdBJ5183感受态细菌进行同源重组后，抽提卡那霉素抗性的质粒，0.8%脂糖电泳发现有2种质粒：其一分子量约34kb，为可能的重组腺病毒质粒；另一分子量约9kb，为重组转移质粒psh-p53。可以很直观方便地初筛出可能的大片断重组腺病毒质粒（图略）。

       

    PacI酶切分子量约34kb的质粒可出现一条约30～35kb的大片断和一条4.5kb的特征性片断见图4。与预期结果相符。

   

    BstXI酶切鉴定重组腺病毒质粒 PAdEasy-1质粒有6个BstXI酶切位点，可以产生6个片断，依次为11921bp、8237bp、5251bp、4254bp、2379bp、1399bp。其与线性化的psh-p53在BJ5183中发生同源重组的位置只引起片断2的改变。本实验采用Pshuttle-cmv为转移质粒，同源重组后片断2将漂移至11～12kb左右，与片断1重叠，只可以观察到5条带。与预期结果相符。结果见图5。

 

图4  重组腺病毒质粒PAdBJ5183 p53用pacI酶切鉴定

Fig4:Identification of recombinant Adenoviral plasmids by PacI lane1:λDNA/HindⅢ　Marker，lane2:PAdeasy-1/PacI，lane3-6:pAdBJ5183-p53/PacI

 

图5重组腺病毒质粒PAdBJ5183 p53用BstXI酶切鉴定

Fig5  Identification of recombinant Adenoviral plasmids by BstXI cleaven patten

lane1:λDNA/HindⅢ Marker，lane2～4：pAdBJ5183-p53/BstXI；

lane5:PAdeasy-1/BstXI；lane:PAdeasy-1

 

    以酶切鉴定正确的重组腺病毒质粒为模板进行PCR，可扩增出与目的基因大小相符合的片断，见图6。

 

图6  重组腺病毒质粒的PCR鉴定

Fig6  PCR amplified p53 gene of recombinant Adeneviral plasmids lane1:DL2000 marker；lane2-6:pAdBJ5183;lane7:psh-p53 positive control;lane8:negative control

 

    3  讨论

   

    传统的构建重组腺病毒的方法是在293细胞内进行质粒间同源重组，这些方法存在细胞类同源重组效率低、实验周期长等缺点，给研究工作带来了诸多不便；利用生长周期快、操作方便的大肠杆菌实现质粒间同源重组产生腺病毒的方法具有重组效率高、病毒基因组高度一致、不需蚀斑纯

   

    化筛选纯系病毒等优点。在进行细菌内同源重组时，最初的方法是将腺病毒骨架质粒和线性化的重组转移质粒电穿孔共转化大肠杆菌BJ5183，这种方法需要电穿孔仪，而且重组效率相对较低；Zeng等［5］采用两步法进行了改进，先用电穿孔法将骨架质粒PAdEasy-1转化电穿孔感受态大肠杆菌BJ5183，得到BJ5183AdEasy，再将线性化的重组转移质粒电穿孔法转化电穿孔感受态大肠杆菌BJ5183AdEasy进行同源重组，由于该法是将转移质粒转化到已携带有骨架质粒的繁殖能力强的BJ5183菌中，避免了将转移质粒转化到有缺陷或复制能力弱的细菌中，因而成功率提高到94%（16/17），但该法仍然需要电穿孔仪，一般实验室难以推广。笔者将该两步法的电穿孔部分改为传统的氯化钙化学转化法，而且线性化的重组转移质粒不需经过热灭活PmeI酶及凝胶电泳回收，直接用于转化，也得到了较高的重组率（6/8）。本研究正在进行p53基因重组腺病毒生物学特性的研究及对肿瘤细胞作用的研究。

作者：邹昌勇，全家妩，田生和，杨京生，吴季南  中华医药杂志 

作者单位： 430060 湖北武汉，武汉生物制品研究所

【参考文献】

 

    1  顾建人，曹雪涛.基因治疗.北京：科学出版社.2001，197.

    2  Ng P，Parks RJ，Cummings DT，et al.A high-efficiency Cre/loxP-based system for constrction of adenoviral vectors.Hum Gene Ther，10:2667-2672.

    3  Kamen A，Henry 0.Development and optimization of an adenovirus production process.J Gene Med，2004，6:184-192.

    4  He TC，Zhou S，L.T.da Costa，et al.Asimplified system for generating recombinant adenovirus.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（5）:2509-2514.

5  Zeng M，Smith SK，Siegel F，et al.AdEasy system made easier by selecting the viral backbone plasmid preceding homologous recombinanation.Bio Techniques，2001，13（2）:260-262.