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伤寒杆菌O抗与H抗血清的制备及其应用



录入时间:2011-2-24 13:42:29 来源:中华检验医学网

在微生物实验课教学中,肥大反应(widal stest)被列为本科临床专业学生实验的必修内容之一。近年来,由于抗生素的早期应用,临床随机采集的患者血清标本抗体含量很低,实验中很难出现典型的抗原抗体凝集现象,由于实验要用到抗血清,而抗血清又难以买到,价格也昂贵,为了节约经费,使用方便,我们尝试了自制抗血清,并且在实验教学中,通过制备抗血清进行抗原抗体之间免疫学反应,使学生获得有关抗原、抗体、抗原抗体间的免疫反应这些抽象的免疫学的基本知识,使教学获得了较好的效果。
 
  1  材料与方法
 
  1.1  动物的选择  实验动物为家兔,体重1.5 kg/只~2.0 kg/只。
 
  1.2  抗原的制备伤寒杆菌的抗原制备  采用北京生物制品鉴定所提供的国内标准菌株伤寒杆菌“O”接种在普通琼脂平板上约20只~30只,置37 ℃培养18 h~24 h,取培养物作涂片,并行革兰染色,经显微镜观察应均为革兰阴性杆菌的纯培养物,并作生化鉴定,葡萄糖(+)、乳糖(-)、靛基质(-)、尿素(-)、动力(+),并用伤寒诊断血清“O”作玻片凝集,出现颗粒凝集确诊为伤寒杆菌“O”抗原,如有污染杂菌的平板应弃去,而纯培养的平板加5 ml~6 ml无菌生理盐水,用L型玻棒刮下菌苔,离心沉淀(2 500转/min,10 min),同法用无菌生理盐水洗涤两次,弃上清,取沉淀物加适量灭菌生理盐水配成30亿/ml的菌液[1],并按菌量加入0.3%~0.5%甲醛作防腐,置37 ℃作用30 min进行杀菌处理,即为伤寒杆菌“O”菌液,置4 ℃冰箱备用。伤寒杆菌“H”菌液的制备[1],方法同伤寒杆菌“O” 抗原制备,此菌株也来自北京生物制品鉴定所。
 
  1.3  免疫动物的方法[2]  实验动物为家兔,共12只,分别注射伤寒杆菌“O”、“H”菌液各6只,程序见表1。表1:免疫注射程序日期(略)    
 
  2  结果与保存
  
  2.1  抗血清效价测定与保存  于末次免疫1周后在耳缘静脉采血2 ml分离血清,抗血清效价测定采用试管凝集法(肥大反应),用生理盐水作血清稀释液,倍比依次稀释血清,置37 ℃ 24 h后观察结果,以呈现++凝集的血清最高稀释倍数作为血清凝集的效价。达到理想的抗体效价后采用心脏采血收集血清分装成小瓶,每瓶约3 ml~5 ml,做好标记,置-20 ℃冰箱保存。
 
  2.2  试管凝集实验  将10个洁净凝集试管,依次加0.5 ml生理盐水,取1∶400稀释的伤寒杆菌抗血清0.5 ml(血清稀释视抗血清效价而定,效价高稀释倍数就高,教科书上抗血清稀释倍数一般从1∶40开始),加入1号管,混匀后,取0.5 ml加入2号管,混匀,取0.5 ml加入3号管,依次稀释,8号管混匀后吸0.5 ml弃去,10号管为对照管,从10号管开始,从后向前依次加入0.5 ml伤寒杆菌均“O”“H”菌悬液(7亿/ml)[1],各管混匀,置37 ℃静置24 h,使抗原抗体充分反应,判断效价见表2,以呈现50%凝集,出现“++”(上清液稍浑浊,凝集物明显)的最高血清稀释倍数为血清的效价。表2:伤寒杆菌“O”、“H”抗血清凝集效价测定(略)菌液+0.85%盐水-免疫6只家兔伤寒杆菌抗血清的平均几何效价,伤寒“O”抗血清为1∶16 060,“H”抗血清为1∶25 600(见表3)。将“O”“H”抗血清按一定比例混合后,血清适当稀释代替伤寒病人血清,可得到理想的实验结果。表3:伤寒杆菌“O”、“H”抗血清几何平均滴度免疫途径(略)实验注意事项:细菌的培养要无菌操作,不能混入杂菌。所选用的兔子要预先用伤寒杆菌“O”、“H”菌液做抗体检测,不能选用已有抗伤寒杆菌“O”、“H”抗体的兔子。在免疫兔子时注意注射器的灭菌消毒,针头是否堵塞。注射耳缘静脉时,先用酒精将耳缘静脉来回擦,使它充血增粗,易于注射。在两次耳缘静脉注射后,兔子可能会出现身体不适,有拉稀或耳朵腐烂等症状,可减少注射量和次数,等好些再注射。收集血清时,将血液置于干燥的培养皿中,放4 ℃冰箱过夜,次日用滴管吸取,避免震动,以免溶血影响血清质量。
 
 3讨论
 
  经过几届学生的实验,作者认为自制的抗血清实验效果好,使用方便,随用随取。这样避免了因实验材料的购买困难而影响实验课的开设,能保质保量地完成实验教学任务。经济效益较高,购买的抗血清价格昂贵且效价不高,而自制的抗血清不需要耗费太多的材料,可为学校节约实验经费。自制的伤寒杆菌抗血清还可用于血清学的凝集反应,即用已知的伤寒杆菌抗血清与伤寒杆菌菌悬液10亿/ml结合,形成抗原抗体复合物,使学生对抗原、抗体抽象的概念得以了解,也可以观察感觉到它的客观实在,是一个建立免疫学概念的好实验。
作者:蔡玲斐   《实用医技杂志》(杭州师范学院,浙江杭州 310018)
 
  参考文献:
 
  [1]  扬履渭.微生物学及检验技术(沙门氏菌属)[M].广州:广东科技出版社,1992,4:155.
  [2]  蔡玲斐.不同免疫途径制备伤寒抗血清效价的比较[J].杭州医学高等专科学校学报,2002,23(3):106.

 

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