微生物实验室成功地进行细菌菌种保存，对于系统地分析流行菌株的生物学、分子生物学特征和耐药性的变迁，以及对医院感染病原学调查、新药临床研究都十分重要［1］。我们通过对1998年1月～2000年5月两年多时间冰冻保存的VITEK-GNI、GPI、YBC 3种生化鉴定卡共4 700株常见的细菌，选择其中258株常见进行复活再鉴定，以探讨一种操作简便而又实用可靠的保存临床标本分离细菌菌株的方法，现报道如下。

 

　　一、材料和方法

 

　　1.标本来源：258株1998年1月～2000年5月从痰、血、尿、脓液等标本中分离、纯培养的细菌，用VITEK全自动微生物分析仪分析后，其GNI、GPI、YBC生化卡当日即按流水号顺序置-20 ℃冰箱保存。

 

　　2.仪器：VITEK全自动微生物分析仪及配套生化卡、药敏卡。生物梅里埃公司。

 

　　3.方法：把3种鉴定卡直接从-20℃移至35℃，待小孔液体完全融化后，以无菌手续，用注射器抽吸出阳性生长孔内的液体，点种于血平板或沙保弱平板，置35℃孵箱内24～48 h复苏。复苏菌落经分离培养后，用VITEK系统对菌株进行鉴定和药敏试验，以金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、绿脓假单胞菌ATCC27853作质控。

 

　　二、结果

 

　　1.菌株复活率：258株细菌按初始鉴定的结果，以伯杰细菌分类为依据，归纳为葡萄球菌属、链球菌属、肠杆菌科、肠球菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、不动杆菌属、念珠菌属8大类。各类菌属的细菌100%的存活时间：葡萄球菌属、肠杆菌属、念珠菌属为29个月，肠球菌属、黄杆菌属、不动杆菌属为21个月，链球菌属和假单胞菌属为10个月。

 

　　2.生物学特性及耐药谱变化：258株细菌中共218株复活成功，复活菌株的培养特点、形态特征、生化特性均与初始鉴定结果一致，细菌的冻融复活前后药敏谱也基本一致，符合率为93.7%～100%。

 

　　3.反复冻融的影响：从复活的各类菌株中选取30株的生化卡反复冻融5次，每次冰冻的时间保持24 h以上。结果30株细菌5次冻融均复活成功，且其生物学特性及耐药谱未发生明显的变化，证实多次冻融对细菌的保存无影响。

 

　　4.与半固体菌种保存法的比较：用鉴定卡和半固体菌种培养基同时保存12株临床分离菌及3株ATCC25922、ATCC25923、ATCC27853标准菌株6个月对照，其中半固体中的菌株定时转种传代。结果两种方法保存菌株的生物学特性均一致。

 

　　三、讨论

 

　　菌株保存得不成功容易引起菌株的生物学特征改变，甚至是耐药质粒的丢失而改变细菌的耐药谱，某些敏感菌株与抗生素结合位点发生突变而形成耐药［2，3］。根据对258张VITEK生化卡的冻融复活再分析，使我们成功地找到一种利用废弃的VITEK鉴定卡作为临床分离菌株的菌种保存方法，既不需要特殊设备，又不受反复转种影响，因而其生物学特性不易发生变异，细菌的耐药谱也基本保持不变。

 

　　随着全自动微生物分析仪的普及应用，该方法可适合于常规工作的大量菌种保存的应用。对VITEK生化卡内的细菌反复冻融5次，分离出的细菌效果是相同的，证实保存在生化卡上的菌种可进行多次复活利用，为了保证每次都能成功地复苏获得菌株，我们通过试验发现，生化卡上的试验小孔除阳性控制小孔外，其它糖类发酵孔内的细菌均能复活成功，其结果无差异。由于快速复温对细菌的损伤力小［4］，为了保证菌株获得最大的成活率，我们认为对鉴定卡复融应采取由-20直接放35℃孵箱。

作者：孙明洪　陈丽英　吕火祥　刘建栋　沈蓓琼　俞晓洁 《中华医学检验杂志》

　　参考文献

 

　　1，张秀珍，主编. 当代细菌检验与临床. 北京：人民卫生出版社,1999. 401-446.

　　2，Chambers HF, Sachdeva MJ, Hackbarth CJ. Kinetics of pencilin binding to penicillin-binding proteins of Stophylococcus aureus. Biochem J, 1994,301:885-891.

　　3，王清涛，杜小玲，曲寿山，等. 金黄色葡萄球菌耐药性分析. 中华医学检验杂志，1997,20:275.

　　4，章崧英，王泽时，郑斯通，主编. 实用低温学. 北京：科学出版社，1994.73-77.