葡萄球菌是临床较常见的感染菌，随着大量头孢菌素尤其是第三代头孢菌素等高效广谱抗菌药物的广泛使用，耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）在全球范围内不断增加，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）作为MRS和凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）家族中的一员，其检出率和多重耐药性呈逐年增高趋势，已成为医院感染的主要病原菌之一。MRCNS为低毒力条件致病菌，感染后症状不典型，且呈现多重耐药现象，给临床诊断和治疗带来一定困难，高效的检验方法已是必然需要。下面介绍实验室常用的MRCNS的鉴定方法。

 

    1  血浆凝固酶鉴定方法

 

    1.1  血浆凝固酶玻片法、试管法［1］

 

    1.1.1  材料  菌株为实验室保存菌株，新鲜未稀释的兔血浆（或人血浆），生理盐水，金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)与表皮葡萄球菌(ATCC 12228)质控菌株。

 

    1.1.2  方法  玻片法:  取未稀释的新鲜兔血浆和生理盐水各一滴分别滴于载玻片，取待检菌菌落少许，分别混合，立即观察结果，细菌聚集成团块或无法混匀为阳性，反之阴性，用于测定凝集因子；试管法  取3支试管，各加0.5ml 1：4稀释的新鲜兔血浆，加1～3个菌落入1试管，充分研磨均匀，2、3试管加凝固酶阳性、阴性株作对照，置37℃水浴3～4h，观察结果，细菌是试管内血浆凝固呈胶冻状为阳性，反之为阴性，用于测定游离型凝固酶。

 

    1.1.3  方法评价  公认采用兔血浆较好，目前许多实验室用病人血浆或血库血浆来代替，因病人血浆中含有各种抗体、药物，尤其某些病人血浆中纤维蛋白含量低下或受各种不同抗凝剂的影响甚至血浆被污染，故一定程度上影响了结果的准确性。采用玻片法检测凝聚因子，有10％～15％金黄色葡萄球菌呈假阴性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。

 

    1.2  血浆凝固酶阴性葡萄球菌两步法

 

    1.2.1  材料  碱性磷酸酶试剂盒为上海长征公司产品；蕈糖、尿素、鸟氨酸脱羧酶生化试验管与新生霉素药敏纸片、磷霉素药敏纸片购自美国BD公司；厌氧硫乙醇酸盐肉汤用Brewer配方，液面加凡士林，灭菌后换无菌橡皮塞。

 

    1.2.2  方法  按文献［2］操作，尿素、鸟氨酸脱羧酶试验管接种细菌后用消毒液状石蜡覆盖；碱性磷酸酶试验按文献［3］进行。两步法鉴定与结果判定见表1。

 

    1.2.3  方法评价  对第一步鉴定出现相似结果的菌株，可根据提示选用第二步鉴定程序以省时并减少消耗。不能用本法鉴定的科恩、木糖、松鼠、缓慢葡萄球菌在人体内感染极为少见，必要时可用氧化酶、木糖、甘露醇等并参考有关资料进行鉴定。两步法低耗高效，有较高的实用价值。表1  血浆凝固酶阴性葡萄球菌两步法鉴定（略） 注：+：阳性，-：阴性，S：敏感，R：不敏感　

 

    2  甲氧西林耐药性常用鉴定方法

 

    2.1  普通M-H平板纸片扩散法  配制0.5麦氏单位菌液接种于普通M-H平板，贴1μg/片苯唑西林药敏纸片，35℃，24h观察结果（CNS孵育48h），CNS≥18mm为敏感，≤17mm为耐药［４］。

 

    2.2  含4%NaCl的M-H平板纸片扩散法  在M-H培养基中加入4%NaCl倾注平板，实验方法和判读标准同普通M-H平板纸片扩散法。纸片扩散法最大优点是快速、简便、价格便宜，易被检验人员接受。琼脂中如没有NaCl成分，一些菌株的耐药性可能得不到完全表达而导致符合率降低，为使纸片法抑菌圈明显，提高纸片扩散法检测MRCNS的可靠性，最好在MH琼脂中加入40g/L NaCl。

 

    2.3  琼脂筛选法  在含4%NaCl，6μg/ml苯唑西林M-H平板中点种0.5麦氏单位菌液，经35℃，24h（CNS 48h）孵育，只要有一菌落生长即判断为MRS。该法敏感度为100%，常用作校正其他方法的标准，尤其适用于检测抑菌圈直径处于中介度的葡萄球菌。

 

    2.4  全自动微生物分析仪法  目前有Vitek系统、ATB系统、MicroScan系统、Sensiter ARIS等。将菌液稀释后注入药敏板或孔内，然后通过检测菌液浊度，荧光指示剂的荧光强度或荧光底物的水解反应来判读结果。其检测速度比纸片扩散法等更快捷，可以及时给出准确的报告,节约时间，但有时对生长缓慢或延迟表达耐药性的菌株，在3～4h内难以达到检测水平，容易漏检或误报［5］。

 

    3  讨论

 

    目前国内外用以检测MRCNS的方法很多，但要做到效率高、成本低、实用性强还得根据实验室具体条件因地制宜。采用全自动微生物分析仪进行鉴定，简便、准确、快速，适用于大型医院及科研机构；玻片试管法、两步法和纸片扩散法等技术，是目前可采用的较好的方法，简捷、经济、快速可靠，有较高的实用价值，可促进对MRCNS的研究，并适合基层医院推广应用。

作者：房功思， 孟德娣    作者单位：230061 安徽合肥,安徽医学高等专科学校医学技术系

 

【参考文献】

  1 洪秀华.临床微生物学和微生物检验实验指导，第2版.北京：人民卫生出版社，2003，97-110.

2 娄永新，王金良.实用临床细菌学检验与进展.天津：天津科技翻译出版公司，1992，52-56.

3 李金钟，段雄波，相青珍，等.快速微量法测定葡萄球菌碱性磷酸酶.临床检验杂志，1997，15：166-167.

4 姜绯,赵晓萌.凝固酶阴性葡萄球菌的菌种分布及流行变迁.实用医技杂志，2006,5(9):1-3.

5 廖舫,范昕建.耐甲氧葡萄球菌HVR基因分型及其与耐药性关系.华西医大学报，2001，32(2)：167-171.