【摘要】  目的： 了解产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药基因谱及其遗传学特征。方法：对35株产ESBLs肺炎克雷伯菌，采用聚合酶链反应(PCR)检测 aac（3）-Ⅰ,aac（3）-Ⅱ,aac（6′）-Ⅱ,ant（3″）-Ⅰ,ant（2″）-Ⅰ，aac(6′)-Ⅰ，aac(6′)-Ⅰb等7种氨基糖苷类修饰酶基因，TEM,SHV,LEN,OKP,CTXM-1,CTXM-2,CTXM-9,GES,PER,VEB,OXA-10,OXA-1,OXA-2,DHA,ACT-1等15种β-内酰胺酶基因，intI1,intI2,intI3等3种整合子基因，tnpA（TnA转座子标记）,merA（Tn21/Tn501转座子标记），qacEΔ1-sul1消毒剂耐药基因，qnr喹诺酮类耐药基因，共检测29种耐药基因并对部分产物进行测序。结果： 35株肺炎克雷伯菌中检出β-内酰胺酶基因22株，阳性率62.9%。整合子基因阳性22株，阳性率62.9%。氨基糖苷类修饰酶基因阳性26株，阳性率74.3%。tnpA全部阴性。merA 阳性2株，阳性率5.7%。qacEΔ1-sul1阳性13株，阳性率37.1%。qnr全部阴性。在测序中发现一种新的基因型，并以aac(6′)-Ⅰb-Suzhou型命名，登录于美国NCBI(登录号：EF375621)。结论： 产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药基因及耐消毒剂基因的携带率非常高，耐药基因谱及其遗传学特征非常复杂。

 

【关键词】  肺炎克雷伯菌； 耐药基因； 遗传学特征

 

［基金项目］ 苏州市科技计划项目（苏科计SZD0622）

 

　　Resistance gene spectrum and genetics characteristics　of klebsiella pneumoniae producting ESBLs

 

　　XU Wei-dong, XU Hong-xing,  MI Zu-huang, CHEN Zhao-hua, WU Yuan-jian

 

　　(Department of Clinical Laboratory, the Affiliated Suzhou Municipal Hospital of Nanjing Medical University, Suzhou Jiangsu 215002； Wuxi Clone Gen-Tech Institute, Wuxi Jiangsu 214026, China)

 

　　［Abstract］  Objective: To understand the resistance gene spectrum and genetics characteristics of Klebsiella pneumoniae(Kpn)  producting ESBLs.Methods： The genes including aac(3)-Ⅰ，aac(3）-Ⅱ， aac（6′）-Ⅱ，ant（3″）-Ⅰ，ant（2″）-Ⅰ，aac(6′)-Ⅰ，aac（6′）-Ⅰb，TEM，SHV，LEN，OKP，CTX-M-1，CTX-M-2， CTX-M-9，GES，PER，VEB，OXA-10，OXA-1，OXA-2，DHA，ACT-1，intI1, intI2，intI3，tnpA, merA, qnr，qacEΔ1-sul1  were analyzed by PCR. And Some products were sequenced.  Results： β-lactamase gene was found in 62.9％，AMEs gene was found in 74.3％，tnpA was all negative，Integron gene was found in 62.9％，merA was found in 5.7％，qnr was all negative，qacEΔ1-sul1 was found in 37.1％ in 35 Kpn. We found a new genotype and named as aac（6′）-Ⅰb-Suzhou，which we have registrated in NCBI(Login: EF375621). Conclusion： The carrying rates of resistance gene and disinfectant-resistant gene were very high，resistance gene spectrum and genetics characteristics of Kpn producting ESBLs were very complex.

 

　　［Key words］  Klebsiella pneumoniae； resistance gene; genetics characteristics

 

　　近年来肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,Kpn）已成为医院感染的重要病原菌。国家细菌耐药监测网报告对8个省、市自治区的57家三级甲等医院调查(2002年1～12月),Kpn菌分离率列第三位（占8.2%）。Kpn菌对β-内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物出现多重耐药性［1］。新近国内尽管已有Kpn菌的耐药基因研究报道，但所涉及基因种类不够全面［2-4］ 。为了解我院产ESBLs的Kpn菌(Kpn-ESBLs)氨基糖苷类修饰酶基因、β-内酰胺酶基因、喹诺酮类耐药基因、消毒剂-磺胺耐药基因以及整合子基因、转座子基因存在状况，我们对35株分离自患者的Kpn-ESBLs进行了29种基因的检测，现报告如下。

 

　　1  材料与方法

 

　　1.1  菌株来源及鉴定　

　　35株Kpn-ESBLs均分离自2004年11月～2006年4月我院住院患者标本，分别为：痰液或气管分泌物16份，血液16份,尿液3份。全部菌株均使用Walkaway-40细菌鉴定仪鉴定菌种。并根据美国临床实验室标准化委员会（CLSI标准）确认为产ESBLs菌株。

 

　　1.2  抗菌药物敏感性

　　35株Kpn-ESBLs 19种抗菌药物的敏感性见表1。

　　表1  35株Kpn-ESBLs 19种抗菌药物的敏感性（略）

 

　　Tab 1  19 kinds of antibiotics sensitivity of 35 Kpn-ESBLs

 

　　1.3  基因检测　

　　聚合酶链反应法(PCR)检测。PCR引物序列见表2。模板制备为蛋白酶K消化法。基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供，完全按说明书操作。扩增产物作2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶电泳成像仪下观察，并记录结果。

 

　　表2  PCR引物序列（略）

 

　　Tab 2  PCR primer sequences

 

　　2  结果

　　35株Kpn-ESBLs中检出氨基糖苷类修饰酶基因阳性27株(77.1%)；β-内酰胺酶基因22株(62.9%)；喹诺酮类耐药基因qnr全部阴性；消毒剂-磺胺耐药基因qacEΔ1-sul1阳性13株(37.1%)；整合子基因阳性22株(62.9%)；转座子基因merA 阳性2株(5.7%)、tnpA 全部阴性。表3为29种基因检测结果。其中菌株号szey4536分离自2006年4月18日本院住院患者标本，为痰标本，检出aac(6′)-Ⅰb耐药基因，进行测序并与已在美国国立生物信息中心［NCBI］登录的aac（6′）-Ⅰb基因家族序列比对，发现与已登录的全部aac（6′）-Ⅰb基因序列均不同,为新的基因型并以aac(6′)-Ⅰb-Suzhou型命名登录于美国NCBI(登录号：EF375621)。图1为该基因PCR产物测序图。

　　表3  35株Kpn-ESBLs 29种耐药基因检测结果（略）

 

　　Tab 3  Results of 29 kinds of resistance genes of　35 Kpn-ESBLs

　　3  讨论

　　国内尚无全面的Kpn-ESBLs耐药基因研究报道，本研究发现Kpn-ESBLs对β-内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物出现多重耐药性。近年来，国内不断有Kpn菌携带β-内酰胺酶基因的报道 ［3-9］，但氨基糖苷类修饰酶基因的报道鲜见。本组35株Kpn-ESBLs较为系统的β-内酰胺酶基因检测显示：blaTEM阳性18株(51.4%)，blaCTX-M-1 group阳性4株(11.4%)，blaCTX-M-9 group阳性4株(11.4%)、blaLEN阳性2株(5.7%)，blaDHA阳性6株(17.1%)、blaOXA-1 group阳性1株（2.9%），其余9种β内酰胺酶基因均阴性，β-内酰胺酶基因总阳性率达到62.9%。氨基糖苷类修饰酶基因aac（3）-Ⅰ阳性4株（11.4%）、aac（3）-Ⅱ阳性7株（20%）、 aac（6′）-Ⅰ阳性13株（37.1%）、aac（6′）-Ⅱ阳性7株（20%）、ant（3″）-Ⅰ阳性11株（31.4%）、ant（2″）-Ⅰ阳性12株（34.2%）、aac（6′）-Ⅰb阳性12株（34.2%），总氨基糖苷类修饰酶基因阳性率高达77.1%，可见该类药物耐药情况非常严重。本文氨基糖苷类修饰酶基因检出率高于耐药率，这可能与经修饰钝化后的抗菌药物仍具有相当抗菌活性有关。本文发现的szey4536号菌aac（6′）-Ⅰb基因经比对与先前已在美国NCBI登录的均不相同［10］(包括2006年初，美国学者发现的新氨基糖苷类修饰酶aac(6′)-Ⅰb-Cr型［11］),因此以aac(6′)-Ⅰb-Suzhou型命名，并已登录在美国NCBI。氨基糖苷类修饰酶aac(6′)-Ⅰb-Suzhou新的基因型是否表达新的氨基糖苷类药物修饰谱有待于进一步研究。

　　整合子是继转座子之后新发现的可移动基因元件, 整合子更易在同种细菌和不同种类细菌中进行基因的水平转移,从而使细菌的耐药性得以快速传播［12］。耐消毒剂qacEΔ1与sul1基因为重叠基因, 本研究在qacEΔ1下游设计引物P1, 在sul1上游设计引物P2。PCR扩增阳性表示qacEΔ1与sul1基因同时存在。我院35株Kpn-ESBLs中qacEΔ1-sul1基因阳性13株(37.1%)，即我院三分之一左右的Kpn-ESBLs已携带耐消毒剂与磺胺基因。本研究发现Ⅰ类整合子基因（intⅠ1）阳性率较高，达60%，而Ⅱ,Ⅲ类整合子基因（intⅠ2，intⅠ3）阳性率较低，说明耐药菌 Ⅰ类整合子携带率高，同时也是我国细菌临床分离株耐药性连年上升的重要原因。近年来大量文献报道,覆有氯已定和磺胺的Ⅱ代导管能有效预防细菌定植和细菌生物膜形成［13-15］。氯已定与磺胺耐药基因的高检出率, 提示对Ⅱ代导管的抑菌效能需要再认识和再评价。

  作者：徐卫东，徐红星， 糜祖煌，陈昭华, 吴元健

作者单位：南京医科大学附属苏州市立医院检验科，江苏 苏州 215002； 无锡市克隆遗传技术研究所，江苏 无锡 214026

【参考文献】

  　　［1］ 马 越，李景云，张新妹，等.2002年临床常见细菌耐药性监测［J］.中华检验医学杂志，2004，27(1)：38-45.

　　［2］ 胡大春,邵剑春,杨绍敏,等.肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶的基因研究［J］.中国抗生素杂志,2006，31(1):19-22.

　　［3］ 陈生汶,卢月梅,张阮章,等.大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶的基因分型研究［J］.中华检验医学杂志,2006，29(2):166-167.

　　［4］ 冯福英,胡望平,杨湘越, 等.耐头孢西丁革兰阴性杆菌高产AmpC酶发生率及其基因型和耐药性［J］.中国人兽共患病学报,2006,22(4):363-367.

　　［5］ 杜 敏，陈 旭，马尚柱，等.新疆地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶的基因型研究［J］.中华医院感染学杂志,2006,16(4):361-364.

　　［6］ 孙自镛,程黎明,朱旭慧,等. 产超广谱β内酰胺酶49株细菌耐药基因调查［J］.中华检验医学杂志,2006,29(9):793-796.

　　［7］ 宁永忠，王 辉，孙宏莉,等. 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产生的超广谱β-内酰胺酶和质粒AmpC型β-内酰胺酶分子流行病学研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2006,26(10):944-949.

　　［8］ 王文晶，黄 茂，赵旺胜，等.下呼吸道感染产ESBLs肺炎克雷伯菌基因型分析［J］. 中国感染与化疗杂志,2006,6(6):389-392.

　　［9］ 刘朝晖，张盛斌，杨银悔，等.产超广谱β-大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌blaCTX-M基因型及耐药性检测［J］.世界感染杂志,2006,6(6):504-508.

　　［10］ 徐卫东，徐红星，糜祖煌，等.产ESBLs肺炎克雷伯菌中新的氨基糖苷类修饰酶基因型［J］. 江苏大学学报:医学版，2007，5（17）：441-444.

　　［11］ Robicsek A,Strahilevitz J,Jacobk GA,et al.Fluorpquinolone-modifying enzyme:a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase［J］.Nat Med,2006,12(1):83-88.

　　［12］ Fluit AC, Schmitz FJ. Class 1 integrons, gene cassettes, mobility, and epidemiology［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1999,18(11):761-770.

　　［13］ Maki DG,Stolz SM,Wheeler S,et al.Prevention of central venous catheter-related bloodstream infection by use of an antiseptic-impregnated catheter. A randomized, controlled trial［J］. Ann Intern Med， 1997,127(4):257-266.

　　［14］ Heard SO,Wagle M,Vijayakumar E, et al.Influence of triple-lumen central venous catheters coated with chlorhexidine and silver sulfadiazine on the incidence of catheter-related bacteremia［J］. Arch Intern Med,1998, 158(1):81-87.

［15］ Sheng WH,Ko WJ,Wang JT, et al. evalsuation of antiseptic-impregnated central venous catheters for prevention of catheter-related infection in intensive care unit patients［J］. Diagn Microbiol Infect Dis,2000, 38(1):1-5.