【摘要】  目的：分析耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)检测方法及其耐药性。方法：采用头孢西丁纸片法和PCR两种方法检测临床分离的60株金黄色葡萄球菌中MRSA菌株;纸片扩散法测定金黄色葡萄球菌对15种抗菌药物的敏感性。结果：纸片法及PCR法对MRSA检出率分别为15%、13.3%,两种方法对MRSA检出率差异无统计学意义（P＜0.05）。以PCR法检出mecA、femB基因为判断MRSA的金标准。除了替考拉宁、万古霉素以外,其余抗生素的耐药率MRSA组均明显高于MSSA组(P<0.01)。结论：头孢西丁纸片法是筛选和确认MRSA菌株的一种可靠、简便的方法;MRSA为多重耐药菌株,临床应加强检测。

 

【关键词】  耐甲氧西林;金黄色葡萄球菌,R4/E3C

 

　　Study on insecticide tolerance of Methicillin resistant Staphylococcus aureus

 

　　FANG Qiang

 

　　Department of Bioengineering, Changchun Industry University, Changchun 130012, China

 

    Abstract: Objective  To analyze differentiate of detecting Methicillin resistant Staphy lococeus aureus ( MRSA) and investigate the changes of antimicrobial susceptibility of staphylococcus aureus in order to guide a reasonable use of antibiotics. Methods  Sixty strains of S. aureus isolated from clinical specimens were tested for K-B to 15 antibiotics. Results   The isolate rate of K-B and PCR method was 15% and 13.3%,respectively, which there was not significant difference (P>0.05). The double-PCR was goaden criterion for MRSA. Except for Vancomyem and Teicoplanin , the susceptiblility of MRSA was lower than MSSA. Conclusion    K-B for Cefoxitin is a reliable and convenient method. Surveillance of the susceptibility of provincial S. aureus to antimicrobial agents is of great importance to both rational use of antibiotics and reduction of resistant strains.

 

    Key Words：Staphylococcus aureus; Susceptibility; Antimicrobial agents

 

    耐甲氧西林金黄色葡萄球菌目前已经成为院内感染的主要病原菌，并逐渐扩展到社区，与艾滋病、病毒性乙型肝炎并列成为世界三大感染性疾病，严重威胁着人类的健康。及时准确的检测MRSA，并合理应用抗菌素，采取严格的隔离和消毒措施，对于控制MRSA院内暴发流行，限制向社区蔓延是十分必要的。

 

　　1   材料与方法

 

　　1.1  菌株来源：为我研究中心收集的2005 年1 月～2005 年12 月吉林省人民医院60 例住院患者各种细菌标本。MRSA 医院感染的诊断按《临床医院感染学》确定［1 ］ 。质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213 均购自卫生部临床检验中心。

 

　　1.2  抗生素纸片及培养基：抗生素纸片均购自北京天坛药物生物技术公司;血琼脂、巧克力琼脂等平板购自天津赛凌科技服务有限公司;药敏试验的M - H 琼脂平板由杭州天和微生物试剂有限公司提供的M - H 琼脂粉按说明要求溶解、灭菌、配制。

 

　　1.3  细菌鉴定：细菌的分离和培养按《全国临床检验操作规程》(第2版) 进行;细菌鉴定采用法国生物梅里埃API staph 鉴定系统和手工法。

 

　　1.4  MRSA株的检测(采用K-B法)：在M-H琼脂中加入2%～4%NaCl溶液,35℃,培养24h,采用较稳定的头孢西丁纸片代替甲氧西林,如金黄色葡萄球菌的抑菌环≤19mm,判定为MRSA株。

 

　　1.5  mecA～femB双重PCR体系及扩增条件［2］：94℃预变性4min，94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸60s，进行30次循环，最后72℃延伸2min，反应结束后，将PCR产物于4℃保存。mecA和femB基因扩增引物见表1，参照JonasD［3］等报道设计，由上海生物工程有限公司合成。表1  PCR扩增mecA和femB基因所用引物（略）

 

　　1.6  药敏试验：采用K-B法,其操作及结果判定按照美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)颁布的规则(2000年版)进行［1］。

 

　　2  结果

 

　　2.1  K-B法检测MRSA：60株金黄色葡萄球菌通过K-B法检测MRSA，结果有9株为MRSA，51株为MSSA。

 

　　2.2  MRSA确证试验：mecA～femB双重PCR对K-B法检测的9株MRSA进行确证试验，其中8株为MRSA，另一株为mecA阴性，femB阳性，为MSSA。表2  mecA、femB基因在不同种类葡萄球菌中的表达（略） 注：MRSA－苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌；MSSA－苯唑西林敏感的金黄色葡萄球菌；MRSCoN－苯唑西林耐药的凝固酶阴性葡萄球菌；MSSCoN－苯唑西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌

 

　　2.3  对8株MRSA进行药敏试验：结果如表3。表3  8株MRSA的耐药情况（略）注：M：100bp DNA ladder marker；1：MRSA阳性对照株（协和医院细菌室提供）的PCR扩增产物；2：MSSA（ATCC25923）的PCR扩增产物；3-13：MRSA株的PCR扩增产物。

 

　　3  讨论

 

    对MRSA的检测，除检验科常用、快速的纸片扩散法外，根据文献报道（原理见表2），还需要进行mecA～femB双重PCR确证试验。本研究对K-B检测的9株菌再次进行确证试验，结果发现其中1株为MSSA。

 

    MRSA的分离率与不同时期、不同地域及抗生素选择压力不同等多种因素有关，但总体来说，呈缓慢上升趋势。本研究调查的5家教学医院中，MRSA平均分离率为53.9％，高于李家泰［4］于2000年～2001年对我国13家医院监测的平均分离率（37.4％）。其中上海中山医院MRSA分离率最高（79.5％），这与2004年汪复［5］教授等人对上海地区14家医院监测的结果63.9％（56.0％～86.5％）接近；武汉最低（31.6％）；浙江与武汉接近，为35％，基本接近张绍银［6］报道的结果（43.2％）。

 

    另外，MRSA的危害性更严重的表现在对多种药物的多重耐药性，特别是β－内酰胺酶阳性的菌株，其耐药频率更高。表1中可以看出，MRSA对许多抗生素包括青霉素G、头孢类、大环内酯类、四环素类、单一抗生素类的庆大霉素、克林霉素等均表现为大于90％耐药，对于常用抗生素利福平也有不同程度的耐药，即使体外药敏敏感，但治疗效果不理想。唯独万古霉素、替考拉宁对其有100％敏感。MSSA对青霉素也有90％以上耐药，对红霉素和克林霉素的敏感率也已经降低至30％～60％，对奎诺酮类抗菌药物的敏感率已经低于90％，对头孢类抗菌药物还保持90％左右的敏感。由此可见，如果长期大量的滥用抗菌药物，即使是MSSA，耐药谱也会逐渐扩大。所有金黄色葡萄球菌对万古霉素和替考拉宁仍表现为100％敏感。目前，万古霉素是治疗MRSA感染的首选药物。但是，一旦大量使用万古霉素，又有潜在的耐万古霉素菌株出现的可能。自2002年美国报道了第1株耐万古霉素的金黄色葡萄球菌以来，先后出现3株VRSA［7］。我国尚无耐万古霉素金葡菌的报道。如万古霉素对MRSA治疗无效，那么后果不堪设想。

 

    总之，快速、准确的检测MRSA，及时监测耐药谱，对发生MRSA暴发流行的控制，知道临床实践具有重要意义。

作者：房强    作者单位：长春工业大学生物工程学院，吉林 长春 130012

 

【参考文献】

  　　［1］山东省卫生厅.医院感染管理手册［M］.济南:山东科学技术出版社,2000：53-69.

　　［2］Daum RS, Ito T, Hiramatsu K, et al. A novel Methicillin resistance cassette in community acquired Methicillin resistant Staphylococcus aureus isolates of diverse genetic backgrounds［J］. J Infect Dis，2002，186:134.

　　［3］Berger Bachi B. Expression of resistance to methicillin［J］. Trends Microbiol, 1994,2:389.

　　［4］李家泰，李 耘，王 进.中国医院和社区获得性感染革兰阳性球菌耐药性监测研究［J］.中华医学杂志，2003，83（5）：365.

　　［5］德 妹，汪 复，张婴元.2004年上海地区细菌耐药性监测［J］.中国抗感染化疗杂志，2005，5（4）：195.

　　［6］张绍银.846株金葡菌中耐甲氧西林葡萄球菌的分离结果及耐药性分析［J］.实用医学杂志，2005，21（3）：257.

　　［7］Fred C，Tenover，McDonald LC. Vancomycin－resistant staphylococci and enterococci：epidemiology and control［J］.Curr Opin Infect Dis,2005,18：300.