新生隐球菌（Cryptococcus  neoformans）是一种深部致病真菌，可在土壤、鸟粪，尤其是鸽粪中大量存在。人因吸入鸽粪污染的空气而感染，引起隐球菌病。荚膜多糖是其重要的致病物质［1］。在微生物实验教学过程中，常需要培养出形态典型的新生隐球菌，即圆形或卵圆形的菌体外周有一圈透明的肥厚荚膜。常规培养将菌种接种于沙保弱琼脂培养基，室温或37℃培养2～5天后形成白色,不规则的酵母型菌落。镜检可见圆形或卵圆形菌体，常观察不到宽厚的荚膜，我们采用两种方法培养出带荚膜的新型隐球菌，现介绍如下。

 

　　1  实验材料

 

　　沙保弱琼脂高层斜面培养基（常规方法配制）；无菌兔血清 ； "一得阁"墨汁；新生隐球菌菌种（本实验室保存）。

 

　　2  实验方法

 

　　2．1  传统方法  （1）将新生隐球菌菌种接种于高层斜面沙保弱琼脂培养基上，电热恒温培养箱37℃培养约48h可形成肉眼可见的菌落。（2）取菌苔用生理盐水稀释成浓度为108个/ml（麦氏比浊管第7管）菌液，注意浓度不能过高，否则小鼠易迅速死亡。（3）腹腔注射（方法：先将针头平穿入小白鼠腹腔皮下，再将针头立起刺入腹腔内，这样可防止拔针后菌液外溢）接种剂量分别为0.5、0.7、 1.0、1.2、 1.5ml。每种用量3只，用不同颜色标记不同剂量。注射时小白鼠头朝下，偏右胯，偏离生殖器。（4）观察小白鼠（一般至少9天才会有反应，方有芽孢长出），待发病后，处死解剖，用棉签直接取腹腔液涂片，用火柴棒取墨汁与其混合均匀，加盖玻片，尽量避免产生气泡，置显微镜下观察有无新型隐球菌宽厚荚膜和芽生孢子。

 

　　2．2  改良方法［2］  （1）将新型生球菌接种于沙氏斜面培养基上，置37℃培养至肉眼可见培养基表面有菌生长(约2天)。(2)将无菌兔血清加入沙氏斜面培养物中，其量约占斜面高度一半。然后倾斜试管，使血清完全淹没整个斜面。再将试管直立。置37℃培养5～8天。(3)取上述培养基靠近液面处的培养物少许与一滴墨汁在玻璃片上混合，加上盖玻片，轻压，使标本混合变薄，在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞，找到后转换高倍镜确认。

 

　　3  实验结果 

 

两种方法均能找到菌体大且荚膜肥厚的新型隐球菌。4  讨论(1) 传统方法虽能获得满意结果，但操作繁杂，耗时长，实验过程中易污染环境。(2) 改良培养方法，实验材料易获得，操作简便安全，获得的菌体形态典型。（3）经多次实验发现，传统方法在小白鼠体内实验获得的新生隐球菌多且芽生现象明显，荚膜直径较改良方法稍大。

 

作者：王 娅，冯桂香，金志雄，朱明磊    作者单位：442000 湖北十堰,郧阳医学院病原学实验室

 

【参考文献】

  　1 李凡，刘晶星.医学微生物学.北京： 人民卫生出版社，2008，340-341.

　　2 黄小珠.新型隐球菌培养方法.卫生职业教育,2007， 25（5）：108.