【摘要】  　　目的 调查泰州地区各医院主要致病菌的消毒剂耐药情况。 方法 在泰州地区5所医院的各类环境、高危科室、使用中消毒剂进行采样，在样品中分离和鉴定4种常见致病菌（金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌），选择分离得到的菌株，在常用高中低效消毒剂内分别选取一种（84、碘伏、醋酸氯已定），测定消毒剂对菌株的最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC），与标准菌株比较，确定耐药菌株，并统计分析。 结果 分离4种致病菌共62株，包括金黄色葡萄球菌10株，表皮葡萄球菌14株，铜绿假单胞菌28株，大肠埃希菌10株。金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌对碘伏、醋酸氯已定未发现抗药性产生；表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌对84未发现抗药性产生；分离出6株金黄色葡萄球菌对84已经产生抗药性（耐药率60%）。 结论 医院消毒剂使用不合理，尤其是高效消毒剂滥用，已致使医院菌株对常用消毒剂产生抗药性。

 

【关键词】  消毒剂 金黄色葡萄球菌 耐药性

 

　　消毒灭菌是控制医院感染的重要方法，随着消毒剂的应用，细菌对消毒剂逐渐产生耐药性是不可避免的。消毒剂抗药性在全球呈上升趋势，而相关研究在国内尚处于起步阶段。本文在医院常用消毒剂使用和常见病原体分布调查的基础上对常见致病菌耐药情况进行研究分析，旨在为为卫生行政部门制订安全、合理、有效的消毒剂使用规范提供参考，预防和减少耐药性细菌的产生。

 

　　1  材料与方法

 

　　1.1  标准菌株  革兰阳性球菌以金黄色葡萄球菌ATCC6538为标准菌株，革兰阴性杆菌以大肠杆菌8 099为标准菌株。取第10代营养琼脂24h培养物，制成 5×108cfu/ml 金黄色葡萄菌、大肠杆菌悬液。

 

　　1.2  主要试剂和仪器  0.5%碘伏和0.5%醋酸氯已定购自兴化市医疗用品公司;“84”消毒液(原液有效含氯量为4%,试验时用无菌蒸馏水稀释200倍)为江苏爱特福公司产品; ATB自动细菌鉴定仪和生化鉴定试剂条为法国生物梅里埃产品。

 

　　1.3  致病菌分离和鉴定  参照国家标准GB/T 18204-2000［1］和《伯杰氏细菌手册》［2］的相关条目处理样品、分离和鉴定4种致病菌，大量样品用ATB自动细菌鉴定仪鉴定。

 

　　1.4  实验方法［3］

 

　　1.4.1  有效含量测定  有效碘、有效氯、醋酸氯已定含量的测定按《消毒技术规范》2002版的有关方法进行检测。

 

　　1.4.2  中和剂选择试验  采用中和剂鉴定试验分别对每种消毒剂的中和剂进行选择，最终确定0.5%碘伏用1.0%硫代硫酸钠、0.5%醋酸氯已定用5.0%吐温80、84消毒液用1.0%硫代硫酸钠。

 

　　1.4.3  细菌繁殖体悬液的制备  取冻干菌种管，超净台内打开，以吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0 ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂平板上，于37℃ 培养24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃ 培养24h，即为第3代培养物。取菌种第6代的营养琼脂斜面新鲜培养物，用吸管吸取5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用吸管将洗液移至另一无菌试管中，在手掌上振敲 80 次，以使细菌悬浮均匀。初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以含1%蛋白胨的PBS稀释至5×108cfu/ml。试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其作用浓度应为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。细菌繁殖体悬液暂存在 4℃冰箱内备用，不得过夜。

 

　　1.4.4  最小抑菌浓度试验(MIC)  采用试管系列稀释法。在双倍营养肉汤5ml中加入0.1ml菌悬液，再加入经过倍比稀释的不同浓度消毒剂5ml，接种时，应由低浓度向高浓度依次接种，留2支不加消毒剂，作为阳性对照，取2支含营养肉汤的试管，作为阴性对照。所有样本经37℃培养48h，观察试管肉汤的变化，以抑制细菌生长的最低浓度为MIC值。试验重复3次，以其平均值确定医院常见菌株和标准菌株的MIC值。

 

　　1.4.5  最小杀菌浓度试验(MBC)  采用试管系列稀释法，并用中和剂中止残留消毒剂的作用。在双倍营养肉汤5ml中加入0.1ml菌悬液，再加入经过倍比稀释的不同浓度消毒剂5ml，同样设阳性和阴性对照，作用4h后用中和剂1.5ml中止残留消毒剂的作用；10min后，经37℃培养48h，观察试管肉汤的变化，无细菌生长的最低浓度即为MBC值。试验重复3次，以其平均值确定医院常见菌株和标准菌株的MBC值。

 

　　2  结果

 

　　2.1  致病菌分离鉴定  在医院各类环境中共分离微生物90株，其中有金黄色葡萄球菌10株，表皮葡萄球菌14株，绿脓杆菌28株，大肠埃希菌10株。

 

　　2.2  3种消毒剂对金黄色葡萄球菌的抑菌、杀菌结果  结果显示，碘伏、醋酸氯已定对7株金黄色葡萄球菌MIC一致，分别为312.5mg/L、5.0mg/L，小于或等于标准菌株的MIC；对7株金黄色葡萄球菌MBC一致，分别为625mg/L、500mg/L，等于标准菌株的MBC。另外，分离出一株金黄色葡萄球菌MIC值为800mg/L,MBC值为800mg/L，大于标准菌株的MIC、MBC值。见表1。

 

　　表1  3种消毒剂对10株金黄色葡萄球菌MIC、MBC试验结果（略）

 

　　注：试验温度为20～22℃，试验重复3次，质控样品结果无异常，此表中未列出。

 

　　2.3  3种消毒剂对表皮葡萄球菌的抑菌、杀菌结果  实验发现表皮葡萄球菌对84、碘伏、醋酸氯已定的MIC分别在200mg/L、312.5mg/L、5.0mg/L，小于或等于标准菌株的MIC。MBC分别在400mg/L、625mg/L、500mg/L，小于或等于标准菌株的MBC。

 

　　2.4  3种消毒剂对大肠埃希菌MIC、MBC试验结果  消毒剂对各菌株的MIC、MBC结果如下：同一消毒剂对不同菌株的MIC、MBC值均相同，84、碘伏、醋酸氯已定分别在400mg/L、312.5mg/L、3.2mg/L，与标准菌株的MIC相同。MBC分别在800mg/L、625mg/L、12.5mg/L，与标准菌株的MBC相同。

 

　　2.5  3种消毒剂对绿脓杆菌的抑菌、杀菌结果  在本试验条件下，测得84、碘伏、醋酸氯已定对绿脓杆菌的MIC分别为200mg/L、312.5mg/L、3.2mg/L，小于或等于标准菌株的MIC。MBC分别为800mg/L、625mg/L、12.5mg/L, 小于或等于标准菌株的MBC。

 

　　3  讨论

   

　　医院感染面临的挑战主要来自三个方面，即病原体、人类本身以及周围环境,消毒灭菌是控制医院感染的重要途径。通过消毒和灭菌工作，可杀灭或消除医院环境中、医疗用品及日常生活用品上的病原体，切断传播途径，消除环境储源，防止医院感染发生。但在上世纪60年代，国外陆续发现许多菌株对消毒剂产生抗性，最早的是季胺盐类（QAC），随之是双胍类如洗必太，近年来又发现对酚类、醇类、碘类的抗性。随着细菌对消毒剂抗性的产生，其杀菌效能日见低下，不得不一再更新。

   

　　本次实验选择医院分离的4种常见致病菌，在常用高中低效消毒剂内分别选取一种，通过最小抑菌浓度试验和最小杀菌浓度试验检测致病菌对常用消毒剂的抗药性。结果显示分离出的10株金黄色葡萄球菌中有６株对84已经产生抗药性。但未对其他消毒剂产生抗药性。从金黄色葡萄球菌对84的单一耐药性提示，细菌对某种消毒剂产生耐药性并不一定对其他类型消毒剂同时产生耐药性，从醋酸氯已定对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的MIC、MBC值不同，提示消毒剂醋酸氯已定对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有不同的抑菌机制。细菌对消毒剂产生抗药性的原因具有多样性，因此消毒剂适量合理的配伍使用会减少耐药的产生和提高效率。

   

　　本研究建立在对本市各大医院消毒剂使用情况和医院常见病原体分布情况调查的基础上，覆盖面较广，基本代表本市实际情况。但实际筛选出的耐药菌株样本量较少，菌种只限于金黄色葡萄球菌，没有能进一步完善耐药质粒谱，没有能完成质粒序列的测定。

 

作者：杨海玉    作者单位：泰州市疾病预防控制中心微生物检验科,江苏 泰州 225300.

【参考文献】

  　　［1］ 中华人民共和国国家标准GB/T 18204-2000.公共场所卫生标准检验方法［S］. 北京：国家质量技术监督局，2001,1.

　　［2］ R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等.伯杰氏细菌手册（中科院微生物研究所译）［M］.北京：科学出版社，1984.

　　［3］ 卫生部.消毒技术规范（2002版）［S］.北京：中华人民共和国卫生部,2002,11.