【摘要】  目的 探讨产志贺毒素大肠埃希菌产超广谱β内酰胺酶(extended spectrum βlactamases，ESBLs)类型及耐药机制。方法 采用纸片琼脂扩散法筛选36株产志贺毒素大肠埃希菌产ESBLs菌株，接合传递实验、质粒谱分析、PCR检测耐药基因和DNA序列分析产ESBLs菌株的表型和基因型。结果 双纸片扩散法证明有2株产志贺毒素大肠埃希菌产ESBLs，美国株E.coli 5 nonO157:H7和中国株E.coli 27 O157:H7对头孢他啶等第三、第四代头孢菌素和氨基糖苷类抗生素耐药，并能通过5.8kb的质粒传递给受体菌。PCR检测含有blaTEM基因。DNA同源分析表明861bp的blaTEM DNA片段与blaTEMI DNA片段同源。结论 产志贺毒素大肠埃希菌美国株和中国株产生相同类型的ESBLs，表现出对第三、第四代β内酰胺酶类抗生素耐药。

【关键词】  产志贺毒素大肠埃希菌超广谱β内酰胺酶 基因型

    Study on the genotype of extended spectrum betalactamases among

    ABSTRACT  Objective  To investigate the genotype and antimicrobial mechanism of extended spectrum betalactamases among Shiga toxinproducing E.coli (STEC).  Methods  Antibiotic susceptibility was tested by the disk diffusion to screen out the strains that produced the ESBLs; conjugative transfer test, plasmid profile, PCR and DNA sequencing were used to detect the phenotype or genotype of STEC.  Results  Of 36 samples, there two isolates producing ESBL, E.coli 5 non O157:H7 from American and E.coli 27 O157:H7 from China, and they both were resistant to aminoglycosides and the third generation cephalosporins such as ceftazidime. Double disk test showed that they produced ESBL and the resistant phenotype were transferred to the recipient by a conjugative plasmid of 5.8kb. TEM βlactamasesencoding gene was identified by PCR and the 861bp fragment of blaTEM DNA had a high homology with that of blaTEM1.  Conclusions  STEC isolates from America and China carry the same genotype ESBLs, which may be the major resistance mechanism against the third and fourth generation cephalosporins.

    KEY WORDS  Shiga toxinproducing E.coli (STEC);  Extended spectrum βlactamases (ESBL);  Genotype

      产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxinproducing E.coli，STEC)有110种血清型，主要血清型O157：H7可引起出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)和溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome，HUS)。牛羊等动物是其天然宿主，抗菌药物作为动物生长促生长剂，造成动物肠道细菌多重耐药， 同时STEC感染的临床患者在应用广谱抗生素进行治疗时，可导致STEC多药耐药菌株的增加［1］。

    ESBLs主要由革兰阴性菌产生，通过质粒介导，对包括第一、第二和第三代头孢菌素以及氨曲南在内的β内酰胺酶类广谱抗生素具有水解作用［2］。ESBLs的种类超过200余种，最常见的是TEM和SHV型衍生的β内酰胺酶，还包括PER型酶、CTX型酶及VEB1等型酶［3］。ESBLs编码基因具有可转移性，随质粒在同种或不同种细菌间传播，导致耐药基因快速传播。国内、外不同地区肠杆菌科分离株所产生ESBLs的类型不一，以TEM型和SHV型多见，而STEC产ESBLs菌株流行情况国内、外均未见报道。本文应用细菌学与分子生物学方法研究STEC菌株ESBLs的表型及基因型，探讨STEC产ESBLs的基因类型及耐药机制。

    1  材料与方法                      

    1.1  菌株来源

    STEC共36株，其中20株为美国分离株，16株为中国分离株。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、金葡菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853由吉林大学基础医学院病原生物学教研室提供。

    1.2  试剂

    实验用MH培养基和药敏纸片购自Oxoid公司；药敏纸片(μg/片)包括：氨苄西林(AMPC)10，头孢曲松(CRO)30，头孢他啶(CAZ)30，头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CA)30/10，头孢噻肟(CTX)30，头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CA)30/10，氨曲南(AZ)30，氨苄西林/舒巴坦(AMPC/SB)10/10，阿莫西林/克拉维酸(AMPC/CA)10/10，亚胺培南(IMP)10，氯霉素(CHL)30，庆大霉素(GM)10，四环素(TC)30，环丙沙星(CPLX)5，复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)1.2/23.7，红霉素(EM)15，链霉素(SM)10和阿米卡星(AMK)50；Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、DNA分子标准参照物购自TaKaRa。PCR产物纯化、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自QIAGen公司。

    1.3  仪器

    GeneAmpR PCR System2700 Applied Biosesystem(USA)，DYYⅢ型水平电泳仪(北京市六一仪器厂)，UV WHITE2020D凝胶成像分析系统(USA，cold spring)。

    1.4  药敏实验

    采用琼脂纸片扩散法测定36株STEC对18种抗菌药物的敏感性，药敏判定标准遵照美国临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS 2002)规定执行。大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853作为药敏质控菌株［4］。

    1.5  ESBLs表型确定试验

    采用双纸片协同试验，将初选可疑ESBLs菌株用头孢噻肟、头孢噻肟+克拉维酸、头孢他啶及头孢他啶+克拉维酸分别测定纸片的中心距离，抑菌环直径增大≥5mm为产ESBLs阳性［4］。

    1.6  质粒提取及质粒图谱分析

    用QIA快速质粒提取试剂盒按说明书方法提取质粒，0.6%琼脂糖凝胶电泳12h，凝胶成像系统照相分析。

    1.7  接合传递试验

    供体菌为产ESBLs的STEC，受体菌为E.coli C600，采用含有利福平(150μg/ml)和头孢他啶(500μg/ml)的MH培养基进行转接合子的筛选。进行转接合子耐药表型的鉴定，碱裂解法直接提取细菌转接合子DNA。

    1.8  PCR扩增

    (1)引物设计  根据GenBank公布的blaTEM和blaSHV DNA序列分别设计合成2对特异性引物，分别扩增861和392bp片段，由上海生物工程公司合成。

    blaTEM引物：

    P1: FATGAGTATTCAACATTTCCGTG;

    P2:RTTACCAATGCTTAATCAGTGAG

    blaSHV引物：

    P1: FAGGATTGACTGCCTTTTTG;

    P2:RATTTGCTGATTTCGCTCG

    (2)DNA模板的制备  用含抗生素营养培养基筛选耐药菌株，转种3ml含抗生素LB培养基震荡培养过夜，取500μl培养液于Eppendorf管中，12000r/min离心30s，弃上清，加500μl双蒸水，振荡混匀，置100℃水浴15min，12000r/min离心5min，上清液为DNA模板。

    (3)PCR反应  反应体系50μl，在0.5mlPCR反应管中依次加入10×缓冲液5μl，2.5mmol/L dNTPs 4μl，10pmol/L引物1和引物2各1.5μl，Taq DNA聚合酶(1U)0.5μl，模板2μl，双蒸水补至50μl。以标准阳性菌株作阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922作阴性对照。

    (4)反应程序  94℃预变性5min，变性1min，退火温度72℃ 1min，30个循环，72℃延伸5min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，分子量100～2000bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析结果。大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照，大肠埃希菌C600(TEM/SHV1)分别作为blaTEM和blaSHV的阳性对照。

1.9  PCR产物序列分析

    扩增产物用QIA快速纯化试剂盒和QIA快速凝胶提取试剂盒方法进行。使用ABI PRISM 377型测序仪对DNA测序。读框分析、氨基酸序列推导及类似性检索在www.ncbi.nlm.nih.gov网站的在线分析工具ORF finder和Blast对序列进行同源性分析。

    2  结果

    2.1  药敏实验

    KB结果显示有2株细菌对阿莫西林/克拉维酸、亚胺培南敏感，对头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松钠第三代头孢菌素耐药，同时对氨基糖苷类及四环素耐药，为可疑产ESBLs细菌。试验结果表明这2株菌对CAZ、CTX、CRO等第三代头孢菌素及AZ纸片相对于AMPC/CA纸片抑菌圈增大7～14mm，提示可能产ESBLs。

    2.2  接合传递实验及质粒谱分析

    接合株E.coli 5 nonO157:H7获得E.coli 5的全部耐药表型。接合株E.coli 27O157:H7除SMZ/TMP外获得E.coli 27全部耐药表型，在E.coli 5和E.coli 27及其接合株中均发现一个大约5.8kb质粒。

    2.3  PCR扩增blaTEM和blaSHV

    E.coli 5和E.coli 27株均扩增出861bp长的blaTEM DNA片段(图1)，未扩增出blaSHV片段(图略)。

    2.4  DNA序列分析

    对2株blaTEM DNA的PCR产物进行基因同源性分析，发现该序列中861bp(nt1～nt861)片段与blaTEM1(GenBank注册号：AY263331)同一性最高，达99.8%，仅在nt512处发生G→A(G512A)突变，导致在104位氨基酸出现(E104K)改变(104位谷氨酸被赖氨酸替代)。

    3  讨论

    自1983年首先发现产ESBLs的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌以来，世界各地均发现产ESBLs细菌。产ESBLs细菌多为院内感染的条件致病菌，其基因类型和检出率有很大差异，多数产生于肠杆菌科ESBLs由窄谱β内酰胺酶TEM1、SHV1编码基因变异，可导致酶活性中心附近的氨基酸残基被取代，改变底物结合腔的空间结构，使第三、第四代头孢菌素、氨曲南等具有较大的空间位阻的底物进入而被水解，造成细菌ESBL种类正在不断地增多并在不断地进化，各种ESBLs的基因型及功能特征有一定程度的差异，同一亚群内ESBLs的功能特征相似。

    TEMESBLs在国内、外流行已发现110种，能灭活多种类型β内酰胺类抗生素。在各个国家、地区、医院流行的亚型各不相同。美国以TEM10、TEM12和TEM26为主；英国以TEM10和TEM12为主，而法国以TEM3为主，同时还有SHV3和SHV4亚型；德国则以SHV2为主［3，5］。

    本实验STEC美国株和中国株产ESBLs以TEM1为主，在TEM1编码基因中第512位发生一个核苷酸的变异，导致第104位谷氨酸被赖氨酸所替代。由于赖氨酸含有一个较长的侧链结构，其氨基与底物基团上的羧基形成静电引力，加强了酶与底物的亲和力；此外，由于构像变化，改变了酶活性位点的键合腔空间构型，使更复杂的新型β内酰胺类抗生素得以与酶活性中心结合，表现对广谱、超广谱β内酰胺类抗生素耐药，仅对头霉素、碳青霉素烯类敏感。2株来源不同国家的STEC具有相同特征的ESBLs基因型，并携带5.8kb可接合性质粒，说明STEC产ESBLs是通过质粒在同种属细菌转移和扩散获得的，具有传播氨基糖苷类等多种抗生素的耐药特性［5，6］。

    STEC是引起大规模食源性食物中毒的主要致病菌。自1982年美国首次暴发以来，世界各地不断有暴发和散发的报道，我国1987年在出血性结肠炎首次分离到O157：H7，1999年江苏、安徽局部地区暴发了O157：H7的流行，流行期长，播散范围广，病死率高。多重耐药STEC菌株携带毒力基因在自然界动物宿主中的广泛存在，对人类构成重大威胁。产ESBL的STEC菌株的不断出现和流行，给临床抗感染治疗带来了更大的难度和更新的课题［6］。

    产ESBLs菌可通过接合、转化和转导等形式使耐药特性在细菌间扩散，并且具有较高的交叉耐药性和多重耐药性，导致患者住院时间延长，费用增加，死亡率增高。同时耐药基因在细菌间扩散，造成严重的医院交叉感染和院外耐药菌的扩散。因此应该对ESBLs细菌进行长期地检测，建立良好的监测机制，尤其对STEC产ESBLs基因的早期监测，可了解STEC多重耐药基因类型的变化与疫情发生发展之间的关系，避免更多的STEC耐药株出现，对临床合理使用抗生素，制定切实有效的预防和控制对策，防止STEC更大范围暴发或流行有重要意义［7～9］。

 

 作者：李明成 李凡《中国抗生素杂志》

【参考文献】

  ［1］ Bettelheim K A, Hornitzky M A, Djordjevic S P, et al. Antibiotic resistance among verocytotoxigenic Escherichia coli and nonSTEC isolated from domestic animals and humans ［J］. Med Microbiol,2003,52:155

［2］ 倪大新，汪华，顾玲，等. 江苏省1999年大肠埃希菌O157：H7宿主动物带菌情况调查［J］. 中华流行病学杂志，2002，23：102

［3］ 陈炫，吕小菊，范昕建. 超广谱β内酰胺酶的分类和分子进化研究进展［J］. 中国抗生素杂志，2003，28(3)：188

［4］ National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing M100S11 ［A］. In: National Committee for Clinical Laboratory Standards ［S］. Wayne, PA,2001

［5］ 王辉，吴伟元，陈民钧. 肠杆菌科细菌中超广谱β内酰胺酶的研究［J］. 中华微生物学和免疫学杂志，2001，21(6)：676

［6］ Karmele C, Javier P, Rodrigo A, et al. Simple and reliable multiplex PCR assay for detection of blaTEM, blaSHV and blaOXA1 gene in Enterobacteriaceae ［J］. FEMS Microbiol Let,2003,223(2):147

［7］ Osterblad M,Hakanen A, Manninen R, et al. A between species comparison of antimicrobial resistance in Enterobacteria in fecal flora ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2000,44:1479

［8］ Blazquez J, Morosini M I, Negri M C, et al. Selection of naturally occurring extendedspectrum TEM betalactamases variants by fluctuating betalactamase pressure ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2000,44(8):2182

［9］ Schroeder C M, Zhao C, DeRoy C, et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli O157：H7 isolated from humans, cattle, swine and food ［J］. Appl Environ Microbiol,2002,68(2):576