【摘要】  目的 研究沈阳地区儿科产超广谱β内酰胺酶(extendedspectrum βlactamases，ESBLs)革兰阴性菌的耐药性及ESBLs基因型分布，初步探讨其多重耐药性传播的分子机制。方法 KB法药敏试验，按照CLSI/NCCLS 2005年标准筛选确认ESBLs表型，PCR法进行ESBLs基因型别分析，扩增I类整合子全可变区，分析产ESBLs菌株中整合子的存在情况。结果 在分离出的180株革兰阴性菌中，有62株经表型确证试验证实为产ESBLs菌株，检出率34.4%。产ESBLs菌株对各种抗菌药物的耐药率明显高于非产ESBLs菌株。基因分型结果表明，blaTEM基因阳性48株(77.4%)，blaSHV阳性32株(51.6%)，blaCTXM9组阳性31株(50%)，blaCTXM3组阳性12株(19.4%)。62株ESBLs菌株中26株整合子全可变区PCR扩增阳性，阳性率41.9%。结论 沈阳地区儿科革兰阴性菌中ESBLs菌株检出率较高，多数菌株同时携带两种或两种以上不同型别的β内酰胺酶，且为多重耐药菌株，整合子机制参与其多重耐药性的形成与传播。

【关键词】  革兰阴性菌；超广谱β内酰胺酶； 耐药； 基因型； 整合子； 沈阳地区； 儿科

　　Investigation of antimicrobial resistance and genotypes of extendedspectrum　βlactamases producing Gramnegative bacteria isolated　from pediatrics in Shenyang

　　ABSTRACT  Objective  To study the antimicrobial resistance and genotypes of extendedspectrum βlactamases (ESBLs)producing Gramnegative bacteria isolated from pediatrics in Shenyang and preliminarily investigate the molecular mechanisms of their multiple antibiotic resistance dissemination process.  Methods Antibiotics susceptibility was tested by KirbyBauer method. ESBLsproducing isolates were detected by phenotypic confirmatory test according to CLSI/NCCLS M100S15 (2005). The genotypes of ESBLs were analyzed by PCR, and the complete variable region of class 1 integron were amplified in order to analyze the presence and characterization of class 1 integron in ESBLs.  Results  Among a total of 180 Gramnegative isolates, 62 isolates were identified as ESBLs by phenotypic confirmatory test and the incidence was 34.4%. The ESBLsproducing isolates were more resistant to most antimicrobials than non ESBLsproducers. The results of βlactamases genotyping showed that 48 isolates carried blaTEM (77.4%)，32 isolates carried blaSHV (51.6%), 31 isolates carried blaCTXM9 (50%)and 12 isolates carried blaCTXM3 (19.4%). Class 1 integrons were identified among 26 isolates and the positive rate was 41.9%.  Conclusions  In Shenyang pediatrics, the incidence of ESBLsproducing strains was high and most isolates were multiple resistant and produced more than one type of βlactamase. The mechanisms of integron took part in the emergence and dissemination of their multiple resistance.

   

　　KEY WORDS  Gramnegative bacteria;  Extendedspectrum βlactamases;  Resistance;  Genotype;  Integron;  Shenyang area;  Pediatrics 

　　产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)是革兰阴性菌对第三代头孢菌素及单环内酰胺类抗菌药物耐药的重要原因［1，2］。儿科患者由于年龄和疾病等因素，是产超广谱β内酰胺酶细菌的易感人群。为了解沈阳地区儿科产超广谱β内酰胺酶革兰阴性菌的耐药情况和基因型特征，为沈阳地区儿科抗生素使用及临床预防产ESBLs细菌引起的感染提供参考依据，本文对2005年1月～2005年12月沈阳市儿科患者中分离的180株革兰阴性杆菌进行ESBLs表型筛选和确认，分别用TEM、SHV、CTXM、OXA、PER和VEB型β内酰胺酶基因的特定引物进行PCR扩增，分析ESBLs基因型别，扩增I类整合子全可变区，探讨其多重耐药性的传播机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  菌株来源

   

　　2005年1月～2005年12月沈阳市儿科患者中临床分离的革兰阴性杆菌180株，其中包括大肠埃希菌59株，克雷伯菌属27株，铜绿假单胞菌29株，不动杆菌属22株，阴沟肠杆菌11株，聚团肠杆菌5株，产气肠杆菌2株，弗氏柠檬酸杆菌5株，黏质沙雷菌7株，液化沙雷菌3株，嗜麦芽寡养单胞菌6株，荧光假单胞菌2株，奇异变形菌1株，摩根摩氏菌1株。所有菌株均采用法国BioMerieux公司全自动微生物鉴定系统的革兰阴性菌鉴定卡确认。

　　1.2  抗生素纸片

   

　　氨苄西林(ABPC)、哌拉西林(PIPC)、阿米卡星(AMK)、头孢呋辛(CXM)、头孢唑林(CEZ)、头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、头孢曲松(CRO)、头孢克洛(CCL)、头孢吡肟(CPE)、头孢西丁(CFX)、哌拉西林/三唑巴坦(PIPC/TB)、环丙沙星(CPLX)、左氧氟沙星(LFLX)、复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)、庆大霉素(GM)、氨曲南(AZ)、亚胺培南(IMP)，头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CA)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CA)和阿莫西林/克拉维酸(AMPC/CA)，以上纸片均为英国Oxoid公司产品。

　　1.3  主要试剂与仪器

   

　　MH(MuellerHinton)琼脂、肉汤培养基为英国Oxoid公司产品；DNA分子量标准(DL2000)、dNTP、Taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司；PCR扩增仪(美国PE公司GeneAmp PCR System 2700型)；DYWI恒压恒流电泳仪(北京六一厂)；凝胶成像系统(美国Kodak公司)。

　　1.4  药敏试验及产ESBLs菌株的筛选与确认

   

　　采用KB纸片扩散法，进行所有菌株的药敏试验。同时按照美国国家临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)2005年版推荐的标准进行ESBLs初步筛选和表型确证试验［3］。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922(阴性对照株)，大肠埃希菌ATCC35218(产广谱β内酰胺酶株)，肺炎克雷伯菌ATCC700603(产超广谱β内酰胺酶株)。

　　1.5  ESBLs基因的PCR扩增

   

　　采用煮沸法提取细菌DNA，取处于对数生长期的新鲜菌液1ml，离心收集菌体，加入600μl双蒸水，煮沸15min，快速冷却，15000r/min离心10min，上清液即可作为DNA模板进行PCR扩增。根据GenBank和EMBL公布的各型ESBLs耐药基因序列设计引物，由大连宝生物公司合成。引物序列见表1。

　　1.6  产ESBLs菌株耐药性传播机制

   

　　根据I类整合子的5′保守区和3′保守区设计引物，扩增其全可变区，分析ESBLs菌株中I类整合子的存在情况。引物序列见表1，循环参数为94℃预变性5min，94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 3min，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

　　2  结果

　　2.1  ESBLs菌株检测结果

   

　　在分离出的180株革兰阴性菌中，62株经表型确证试验证实为产ESBLs菌株，检出率为34.4%，其中大肠埃希菌30株，克雷伯菌属15株，阴沟肠杆菌6株，沙雷菌8株，聚团肠杆菌2株，弗氏柠檬酸杆菌1株。

　　2.2  ESBLs菌株与非ESBLs菌株耐药性比较

   

　　产ESBLs菌株多表现为多重耐药，对各种抗菌药物的耐药率明显高于非产ESBLs菌株。其中ESBLs菌株对氨苄西林、哌拉西林、头孢呋辛、头孢唑林、头孢克洛、头孢噻肟和头孢曲松等7种抗生素的耐药率达到了100%；亚胺培南、阿米卡星、头孢吡肟、头孢他啶、哌拉西林/三唑巴坦对ESBLs菌株仍保持较高抗菌活性，比较结果见表2。

2.3  β内酰胺酶基因型

   

　　本研究采用8对β内酰胺酶基因引物进行扩增，其中blaCTXM2组、blaPER、blaVEB及blaOXA23基因未扩增出阳性结果，blaTEM、blaSHV、blaCTXM3组和blaCTXM9组扩增产物片段大小与预期相符(图1)。62株产ESBLs菌株中blaTEM基因阳性48株(77.4%)，blaSHV阳性32株(51.6%)，blaCTXM9组阳性31株(50%)，blaCTXM3组阳性12株(19.4%)。各型β内酰胺酶基因单独或联合检出情况见表3。       

　　表1  β内酰胺酶基因及I类整合子PCR扩增所用引物　略

　　表2        产ESBLs和非产ESBLs革兰阴性菌的耐药率(略)

　　表3        ESBLs菌株β内酰胺酶基因型分布　略

　　2.4  ESBLs菌株整合子检测

   

　　62株ESBLs菌株中26株整合子全可变区PCR扩增阳性，阳性率41.9%，其中大肠埃希菌10株，克雷伯菌属9株，阴沟肠杆菌3株，聚团肠杆菌2株，沙雷菌2株。阳性菌株扩增片段多介于1000～2000bp之间(常见1.8kb左右的扩增产物)，另有1株扩增产物大于2000bp，1株扩增出两条不同大小片段的阳性带。部分菌株整合子扩增情况见图2。

　　3  讨论

   

　　近年来由于超广谱β内酰胺类抗生素在临床上大量使用，导致产ESBLs的革兰阴性菌不断增加［1］。我国已有部分地区报道大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs检出率超过50%［9，10］。第三代头孢菌素因抗菌谱广、毒性较低等特点，常常在儿科住院患者中大量甚至长期使用，因此儿童ESBLs发生率并不亚于成人。张泓等报道儿童呼吸道感染病原菌ESBLs检出率在大肠埃希菌为32.6%，肺炎克雷伯菌为28.6%［11］。本研究对沈阳地区180株从儿科患者分离的革兰阴性菌进行ESBLs的筛选及确证，检出率为34.4%；本组62株ESBLs全部为多重耐药株，对青霉素、第一、二代头孢菌素及部分第三代头孢菌素的耐药率达到100%，应引起临床医生高度重视。   

　　ESBLs的编码基因分布具有明显的地域特点［2］，如blaTEM和blaSHV型是北美地区流行的主要基因型［12］，韩国以blaSHV12更常见［13］。近年来，非TEM、非SHV型ESBLs种类和数量都不断增加，包括CTXM、PER、VEB和OXA等类型。其中CTXM型酶对头孢噻肟具有强大的水解活性，对头孢曲松的水解能力也很高，但对头孢他啶和氨曲南的水解能力较差。自20世纪90年代初在欧洲发现以来［14］，已遍及东南亚、欧洲等地区［15～17］。我国北京、上海、浙江、广州等地报道的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs基因型也均以CTXM型为主，其次为SHV型［18，19］。本研究发现，沈阳地区儿科CTXM型ESBL累计检出率达69.4%，与其耐药表型相符；本组62株ESBLs头孢噻肟和头孢曲松耐药率达100%，而头孢他啶耐药率仅为40.3%。本组blaTEM和blaSHV基因检出率也较高，分别为77.4%和51.6%，但是否为TEM和SHV型ESBL还有待进一步研究证实。

   

　　整合子介导的多重耐药及水平传播机制近年已越来越引起人们的重视。整合子是具有捕获外源基因并使之转变为功能性基因的表达单位，它可将β内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等多种耐药基因以基因盒的方式组装在一起，并可在菌种内及种间传播，容易引起院内感染的暴发流行［20，21］。本研究结果显示，ESBLs菌株整合子的发生率较高，62株中41.9%携带I类整合子，整合子片段大小介于1.0～3.0kb之间，并有携带多个I类整合子的倾向，它们含有不同的耐药基因，参与形成ESBLs细菌多重耐药表型，并引起菌种内及菌种间多重耐药性的水平传播。

   

沈阳地区儿童也面临着产ESBLs多重耐药的革兰阴性菌感染的威胁，这与临床上长期以来大量使用头孢噻肟等第三代头孢菌素有关。临床抗菌药物大量和不合理应用促进了产酶株的出现，也是整合子发生进化和捕获更多耐药基因的重要原因。因此儿科临床亦应严格限制和合理使用抗生素，进行细菌耐药性的监测，采取积极有效的消毒隔离和治疗措施，以减少产酶菌株的出现，控制ESBLs及其耐药基因的水平传播。

作者：倪朝辉 李凡《中国抗生素杂志》

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