【摘要】  目的 了解铜绿假单胞菌携带多种抗生素灭活酶基因的情况和有关机制。方法应用聚合酶链式反应(PCR)法对多重耐药的铜绿假单胞菌进行β内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因和oprD2基因检测与分析。结果 PCR结果显示CARB和TEM型β内酰胺酶基因，aac(6′)I、aac(6′)II、ant(2″)I、ant(3″)I氨基糖苷类修饰酶基因扩增阳性。oprD2基因扩增检测呈缺失型。CARB和TEM型β内酰胺酶基因扩增产物经测序、BLASTn比对分析为blaCARB3和blaTEM1。结论 铜绿假单胞菌可携带多种抗生素灭活酶基因，多重耐药铜绿假单胞菌(MDRP)的逐渐增多，严重威胁临床的抗感染治疗。

【关键词】  铜绿假单胞菌；抗生素灭活酶； 多重耐药

　　铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为条件致病菌。近年来铜绿假单胞菌多重耐药株引起的感染常使临床治疗面临诸多困难。近年研究发现，铜绿假单胞菌可以通过获得抗生素灭活酶而耐药。如：获得各种β内酰胺酶编码基因和/或外膜孔蛋白oprD2基因缺失导致对β内酰胺类抗生素耐药［1～5］，获得氨基糖苷类修饰酶钝化氨基糖苷类抗生素而耐药［6］。我们从一例肺癌合并严重肺部感染患者的气管分泌物中分离出一株多重耐药铜绿假单胞菌，对其进行β内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因和oprD2基因检测与分析，现报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  标本来源

   

　　患者沈某，女性，81岁。2005年7月因肺癌合并严重肺部感染入院，从患者气管分泌物中分离到铜绿假单胞菌WX2232。

　　1.2  菌株鉴定

   

　　细菌鉴定采用法国VITEK32全自动微生物鉴定系统。

　　1.3  药敏试验

   

　　抗生素敏感试验采用微量肉汤稀释法， 按CLSI/NCCLS(1999年)标准操作及判断结果，抗生素包括氨苄西林、头孢吡肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑林、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方磺胺甲口恶唑、呋南妥因、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦。

　　1.4  耐药基因检测

   

　　(1)模板制备  挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内(管内预置200ng/ml蛋白酶K溶液)。56℃水浴2h，改95℃水浴10min。15000r/min离心30s，上清液移入另一新的0.5ml离心管作为模板液置-20℃冰箱备用。

   

　　(2)耐药基因的检测  β内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因和oprD2基因检测均为聚合酶链反应(PCR)法。PCR扩增引物序列见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各0.5μmol/L，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，TrisHCl(pH9.0)10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%(W/V)，Taq DNA聚合酶1U。总反应体积20μl(其中模板液5μl)。产物>500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃60s→55℃ 60s→72℃ 60s， 循环35个周期，最后一次72℃延长至5min。产物<500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循环35周期，最后一次72℃延长至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性，并摄像保存。测序为双脱氧末端终止法在3730仪(美国ABI公司)上进行。测得序列与美国GenBank核酸库已登录的序列作比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

2  结果

   

　　铜绿假单胞菌WX2232株除对哌拉西林/三唑巴坦敏感(64μg/ml)外，对β内酰胺类(氨苄西林、头孢吡肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑林、亚胺培南、氨曲南、氨苄西林/舒巴坦)、氨基糖苷类(庆大霉素、妥布霉素)、环丙沙星、左氧氟沙星、复方磺胺甲口恶唑、呋南妥因等均耐药。PCR结果显示CARB、TEM型β内酰胺酶基因，aac(6′)I、aac(6′)II、ant(2″)I、ant(3″)I氨基糖苷类修饰酶基因扩增阳性。oprD2基因扩增检测呈缺失型。CARB、TEM型β内酰胺酶基因扩增产物经测序、BLASTn比对分析为blaCARB3和blaTEM1。图1、2为aac(6′)I基因PCR电泳图。

　　3  讨论

   

　　铜绿假单胞菌WX2232株对β内酰胺类(氨苄西林、头孢吡肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑林、亚胺培南、氨曲南、氨苄西林/舒巴坦)、氨基糖苷类(庆大霉素、妥布霉素)抗生素均耐药。PCR检测显示blaCARB(blaCARB3型)、blaTEM(blaTEM1型)、aac(6′)I、aac(6′)II、ant(2″)I、ant(3″)I基因阳性和oprD2基因呈缺失型，表型与基因型相符。oprD2基因所编码的铜绿假

       

　　表1        PCR引物序列　略

　　图1    略

　　图2    略

oprD2基因缺失是铜绿假单胞菌WX2232株亚胺培南、β内酰胺类/β内酰胺酶抑制剂复合制剂耐药的原因。随着广谱头孢菌素类、碳青霉素烯类抗生素在临床上大量使用，铜绿假单胞菌对临床常用抗生素灵敏度不断的下降，尤其是多重耐药铜绿假单胞菌(MDRP)的逐渐增多严重威胁临床的抗感染治疗［8］，如何合理应用抗生素，以及采取有效措施控制耐药株出现，是需要着力解决的问题。

 

作者：王继东  糜祖煌  周丽珍《中国抗生素杂志》

【参考文献】

  　　［1］ 诸葛青云，黄支密，糜祖煌. 耐亚胺培南铜绿假单胞菌和嗜麦芽寡养假单胞菌抗菌药物耐药基因研究［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(11)：677

　　［2］ 植志全，何志恒，江鹏，等. 多重耐药绿脓假单胞菌β内酰胺类氨基糖苷类耐药相关基因研究［J］. 中华检验医学杂志，2005，28(11)：1211

　　［3］ 李智山，邓三季，杨燕，等. 绿脓假单胞菌β内酰胺类耐药相关基因研究［J］. 中华检验医学杂志，2005，28(10)：1030

　　［4］ Patzer J, Toleman M A, Deshpande L M, et al. Pseudomonas aeruginosa strains harbouring an unusual blaVIM4 gene cassette isolated from hospitalized children in Poland (1998～2001) ［J］. J Antimicrob Chemother,2004,53(3):451

　　［5］ Senda K, Arakawa Y, Nakashima K, et al. Multifocal outbreaks of metallobetalactamaseproducing Pseudomonas aeruginosa resistant to broadspectrum betalactams, including carbapenems ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1996,40(2):349

　　［6］ 糜祖煌. 铜绿假单胞菌耐药基因及其检测［J］. 现代实用医学，2004，16(9)：558

　　［7］ 李德淳，汤乃军，李云主译(Richard PW主编). 医院内感染的预防与控制(第4版)［M］. 天津：天津科技翻译出版公司，2005：279

     ［8］ van Eldere J. Multicentre surveillance of Pseudomonas aeruginosa susceptibility patterns in nosocomial infections ［J］. J Antimicrob Chemother,2003,51:347