【摘要】  目的 本实验研究了临床分离的质粒介导AmpC β内酰胺酶大肠埃希菌，在两种接种浓度下(标准浓度105CFU/ml和高浓度107CFU/ml)测定头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦和亚胺培南的MIC值。方法 19株血培养的质粒介导的AmpC β内酰胺酶大肠埃希菌，其中10株单产ACT型，5株单产DHA型，4株产ACT+DHA型。采用琼脂稀释法测定头孢吡肟等5种抗生素在两种接种浓度下的MIC值。高接种浓度下测得的MIC值较标准接种浓度下的MIC值≥8倍时定义为有接种效应。结果在标准接种浓度下，亚胺培南的敏感率为100%，头孢吡肟也有84.2%的高敏感率，头孢哌酮/舒巴坦的敏感率为5.3%，头孢噻肟和头孢他啶的敏感率为0。在两种接种浓度下，头孢吡肟MIC值增加从32倍到100多倍不等，100%有接种效应，而亚胺培南几乎没有接种效应。结论头孢吡肟有明显的接种效应，尽管本文结果为实验室的体外实验结果，但仍建议：头孢吡肟不推荐为临床上治疗由质粒介导AmpC β内酰胺酶大肠埃希菌引起的严重感染的药物。

【关键词】  质粒介导的AmpC β内酰胺酶； 接种效应； 头孢吡肟

    ABSTRACT  Objectives  To investigate the activity of cefepime, cefotaxime, ceftazidime, cefoperzone/sulbactam and imipenem in standard (105 CFU/ml) and high (107 CFU/ml) inoculum MIC tests against clinical isolates.  Methods  A total of 19 Escherichia coli blood isolates producing plasmidmediated AmpCtype βlactamase were selected including 10 isolates of ACT, 5 isolates of DHA and 4 isolates of ACT and DHA. Antimicrobial susceptibilities were determined using broth microdilution MIC tests with standard and 100fold higher inocula. The inoculum effect was defined as an eightfold or greater MIC increase on testing with the higher inoculum compared with the stardard.  Results  Under the standard inoculum, antimicrobial susceptibility rates of imipenem, cefepime and sulperazon were 100%, 84% and 5.3% respectively, both cefotaxime and ceftazidime were 0. In tests with AmpC βlactamaseproducing E.coli isolates, the inoculum effect was most consistently detected with cefepime, cefotaxime, ceftazidime, sulperazon. However, the inoculum effect was least frequently detected with imipenem.  Conclusion  Although the inoculum effect is an in vitro laboratory phenomenon, these results suggest that cefepime may be an unreliable agent for therapy in cases of high inoculum infections caused by AmpC βlactamaseproducing Escherichia coli.

    KEY WORDS  Plasmidmediated AmpCtype βlactamase;  Inoculum effect,;  Cefepime

    革兰阴性菌大多都具有容纳外源性遗传物质的特性，作为医院感染的重要致病菌，继超广谱β内酰胺酶(ESBLs)后，又出现质粒介导的AmpC酶［1］，且质粒介导者因其具有较快的传播速度和较强的耐药性，日益受到人们的重视。据文献报道［2，3］，第四代头孢菌素头孢吡肟可以作为治疗质粒介导产AmpC酶细菌的有效药物，仅次于碳青霉烯类药物。在表型筛选中，第四代头孢菌素是否敏感或有无扩大的抑菌圈常作为区分产AmpC酶和ESBLs的判定方法。但是对于确定的质粒介导的AmpC β内酰胺酶的革兰阴性菌，即使头孢吡肟体外敏感，临床上的治疗也常常不尽人意［4］。本实验研究了19株临床分离的血培养质粒介导的AmpC β内酰胺酶的大肠埃希菌，在不同的接种浓度下头孢吡肟及其它几种头孢类药物的接种效应。

    1  实验材料

    1.1  实验用菌株

    2004年9月～2006年8月，太原地区两家教学医院临床血培养分离的无重复大肠埃希菌216株，经过头孢西丁三维试验、质粒接合传递实验及质粒AmpC酶的基因克隆，获得单产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌19株。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作为对照。

    1.2  培养基和抗生素纸片

    MH(MuellerHinton)琼脂、胰酶消化大豆肉汤及抗生素纸片均为英国Oxoid公司产品。

    2  实验方法

    2.1  产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的筛选及基因型分型

    216株血培养阳性的大肠埃希菌，经表型筛选实验、头孢西丁三维试验、质粒接合传递实验及质粒AmpC酶的基因克隆。

    2.2  药物敏感实验

    采用纸片扩散法(KirbyBauer)进行药物敏感性试验。

    2.3  最低抑菌浓度(MIC)的测定

    按CLSI推荐的肉汤二倍稀释法测定在标准接种浓度105CFU/ml及100倍高浓度107CFU/ml的MIC值。

    根据CLSI/NCCLS 2004年标准，接种浓度为105CFU/ml，实验用5种抗菌药物对大肠埃希菌标准菌株的MIC值的判定标准见表1。当高的接种浓度下MIC≥8倍的标准浓度下的MIC定义为具有接种效果［5］。

    3.1  基因型

    19株质粒介导的AmpC β内酰胺酶大肠埃希菌血培养标本，基因分型为：10株单产ACT型，5株单产DHA型，4株产ACT+DHA型。

    3.2  药敏分析

    5种药物对19株质粒介导产AmpC酶大肠埃希菌在标准接种浓度的耐药情况见表2。表2结果显示，质粒介导产AmpC酶大肠埃希菌对亚胺培南的敏感率为100%，对头孢吡肟也有84.2%的高敏感率，但对第三代头孢菌素头孢他啶、头孢噻肟和头孢哌酮/舒巴坦的敏感性都非常低。

    3.3  2种浓度下的MIC值表1    大肠埃希菌标准菌株对5种抗菌药物的 MIC值判定标准表2  5种抗菌药物对19株大肠埃希菌的耐药分析5种药物对19株质粒介导产AmpC酶的大肠埃希菌在105和107CFU/ml接种浓度下的MIC值见表3。根据Thomson等［5］对接种效应的定义，头孢吡肟具有强的接种效应，在105CFU/ml标准接种浓度和107CFU/ml接种浓度下头孢吡肟的MIC值增加几十倍到上百倍；头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮/舒巴坦在两种接种浓度下的MIC都已经处在耐药范围，对质粒介导产AmpC酶的细菌用此类药物治疗已没有了临床意义。表3结果显示亚胺培南几乎没有接种效应。

    4  讨论

    根据CLSI推荐的MIC测定以及判读标准，第四代头孢菌素(如头孢吡肟)对单产质粒介导产AmpC酶大肠埃希菌有高的敏感率，因此很多文献推荐第四代头孢菌素作为临床上治疗质粒介导产AmpC酶大肠埃希菌的有效的药物［2，6，7］。

    本研究中，在标准的接种浓度105CFU/ml下，头孢吡肟的MIC值较低，按照CLSI的判定标准，头孢吡肟的敏感率达到84.2%；细菌接种浓度由标准接种浓度105CFU/ml提高至107CFU/ml(提高了100倍)时，亚胺培南仍有高的敏感性，而头孢吡肟的敏感性大幅度降低至0。在两种接种浓度下，19株质粒介导的AmpC β内酰胺酶大肠埃希菌对头孢吡肟的MIC值升高几十倍到几百倍，因此，头孢吡肟有强的接种效应，而亚胺培南几乎没有接种效应。在这种情况下，由质粒介导的AmpC β内酰胺酶大肠埃希菌引起的严重感染，感染部位的浓度很可能高于标准浓度105 CFU/ml，达到107CFU/ml，这就使原本敏感的头孢吡表35种药物对19株质粒介导的大肠埃希菌在105和107CFU/ml接种浓度下的MIC值 CAZ：头孢他啶；  CTX：头孢噻肟；  CPE：头孢吡肟；  IMP：亚胺培南；  CPZ/SB：头孢哌酮/舒巴坦。

    肟变成耐药，造成治疗失败。此时，微生物实验室的药敏报告仍然可能为敏感，因为微生物实验室的操作都是在标准浓度下得到的实验结果。

    一般来讲，广谱抗生素不推荐治疗产ESBLs细菌感染，因为体外实验在敏感范围内，体内却常常不敏感，从而提出了“接种效应”的说法。体外实验研究表明，头孢吡肟和其它头孢类抗生素对产ESBLs的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌具有强的接种效应，造成临床治疗失败［5］；在此基础上，有人研究了头孢吡肟对质粒介导的AmpC β内酰胺酶肺炎克雷伯菌的接种效应［8］，同样，头孢吡肟具有接种效应，若菌株同时产ESBLs，其接种效应更强，值得重视。

    本实验发现亚胺培南对质粒介导产AmpC β内酰胺酶的大肠埃希菌几乎没有接种效应，提示临床上应慎用该类药，因为一旦对它耐药，将无药可用。

体外实验敏感，而临床治疗失败，这是临床和实验室之间最大的不一致，如不及时沟通，会造成不必要的误会和不信任。因此，建立快速、准确的监测产质粒介导AmpC β内酰胺酶的实验室方法，加强对抗菌药物的深入研究是非常必要的。尽管该研究为实验室的实验结果，但是我们仍然建议：质粒介导的AmpC β内酰胺酶的大肠埃希菌的严重感染中头孢吡肟可能会导致治疗失败，头孢吡肟不推荐为临床治疗由质粒介导的AmpC β内酰胺酶大肠埃希菌引起的严重感染的药物。

 

作者：段金菊 刘卓拉《中国抗生素杂志》

  ［1］ 宋玮，唐英春. 质粒介导的AmpC β内酰胺酶［J］. 中国抗生素杂志，2004，29(2)：72～78.

［2］ Yan J J, Ko W C, Jung Y C, et al. Emergence of Klebsiella pneumoniae isolates producing inducible DHA1 betalactamase in a university hospital in Taiwan ［J］. J Clin Microbiol,2002,40(9):3121～3126.

［3］ Coudron P E, Hanson N D, Climo M W. Occurrence of extendedspectrum and AmpC betalactamases in bloodstream isolates of Klebsiella pneumoniae: isolates harbor plasmidmediated FOX5 and ACT1 AmpC betalactamases ［J］. J Clin Microbiol,2003,41(2):772～777.

［4］ Livermore D M. betaLactamasemediated resistance and opportunities for its control ［J］. J Antimicrob Chemother,1998,41(Suppl D):25～41.

［5］ Thomson K S, Moland E S. Cefepime, piperacillintazobactam, and the inoculum effect in tests with extendedspectrum betalactamaseproducing Enterobacteriaceae ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2001,45(2):3548～3554.

［6］ 宋玮，唐英春，陆坚，等. 产质粒介导AmpC酶细菌的耐药性及分子流行病学研究［J］. 中国抗感染化疗杂志，2004，4(2)：70～74.

［7］ Gomezdeleon P, Santons J I, Caballero J, et al. Genomic variability of Haemophilus influenzae isolated from Mexican children determined by using enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences and PCR ［J］. J Clin Microbiol,2000,38(7):2504～2511.

［8］ Kang CheolIn, Pai Hyunjoo J. Cefepime and the inoculum effect in tests with Klebsiella pneumoniae producing plasmidmediated AmpCtype βlactamase ［J］. J Antimicrob Chemother,2004,54(6):1130～1133.