【摘要】  从伊纽小单孢菌(Micromonospora inyoensis)扩增参与西索米星生物合成的糖基转移酶基因silD(1181bp)，并分别将其克隆到pUC18和表达载体pET30a上。其开放性阅读框长1173bp，编码含390aa(43.04ku)的多肽链，在大肠埃希菌BL21(DE3)::pETsilD中实现表达。基因silD的碱基序列与gntD(来自M.echinospora)的碱基序列的同源性高达94%。预测的SilD蛋白序列与GntD的同源性为98%。这是继从依纽小单孢菌克隆参与生物合成西索米星的抗性基因srm1(AY661430)、西索米星2脱氧蟹肌醇合成酶基因sisB(DQ250993)和糖基转移酶基因sisZ(DQ250994)后，克隆到的又一新基因。该基因在GenBank的接受号为DQ250992。基因silD的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

【关键词】  糖基转移酶2基因； 伊纽小单孢菌； silD；克隆与表达

    ABSTRACT  The gene silD, a novel glycosyl transferase2 gene, was cloned in our laboratory. The DNA fragment containing silD (1185bp) gene (the key gene involved in sisomicin biosesynthesis) was isolated from Micromonospora inyoensis and cloned into pUC18 vector. Its ORF is composed of 1,173 bp, encoding 390aa (43.04ku). Sequence analysis verified that silD gene and amino acids sequence showed 94% and 98% identity with gntD (glycosyltransferase gene for gentamicin biosesynthesis from M.echinospora), respectively. The prediction of structure of silD suggested it is also a glycosyl transferase protein. The silD expression vector pETsilD was constructed by fusion of the flanking silD ORF in the pET30a plasmid. The silD protein was expressed by IPTG induction in E.coli BL21(DE3):: pETsilD. The successful expression of silD in the E.coli BL21(DE3):: pETsilD will facilitate the further function analysis of the novel gene silD in Micromonospora inyoensis. The silD is a novel gene after cloning the sisomicin resistance gene srm1, glycosyl transferase gene sisZ and 2deoxy scyllo inosose synthase gene sisB from Micromonospora inyoensis.

    KEY WORDS  Glycosyl transferase2 gene;  Micromonospora inyoensis;  silD;  Clone and expression

    放线菌中的小单孢菌属微生物能产生重要的氨基糖苷类抗生素，而氨基糖苷类抗生素是临床上重要的抗感染药物。伊纽小单孢菌(Micromonospora inyoensis)产生的西索米星及其相关的衍生物奈替米星被誉为第三代氨基糖苷类抗生素，是氨基糖苷类抗生素中不良反应最少、抗铜绿假单胞菌作用最强、抗钝化酶能力最广的抗生素，世界卫生组织(WHO)将奈替米星列为对人类健康极其重要的抗感染药物。

    西索米星生物合成途径还未在基因组水平上得到深入研究。采用突变阻断试验，并对突变合成和代谢途径中的中间体进行分析，结果表明西索米星存在复杂的生物合成机制，至少需要连续七步酶促反应步骤，估计参与西索米星生物合成的酶基因有几十个，因为庆大霉素生物合成基因簇总共由30个基因组成［1］。考虑到这些微生物及其药物的重要性，揭开它们生物合成基因簇的排列方式和调节机制是非常有意义的。

    近十多年，已从几株重要的产抗生素小单孢菌中克隆到几个氨基糖苷类抗生素抗性基因，如从绛红小单孢菌和玫瑰小单孢菌中分离到庆大霉素抗性基因grmA和grmB，从兹昂小单孢菌克隆到sgm，从伊纽小单孢菌中分离到sisA等［2～5］。随着对小单孢菌抗性基因研究的不断取得进展［6］，对这类小单孢菌生物合成基因簇的研究也进入了高潮，而且对产同一种抗生素的不同产生菌的基因簇都同时得到了研究，如产庆大霉素的绛红色小单孢菌基因簇［7］和棘孢小单孢菌的基因簇［1，6］。产氨基糖苷类抗生素的其它产生菌同样受得了高度重视，如产卡那霉素的卡那霉素链霉菌的生物合成基因簇［8］、产妥布霉素的黑暗链霉菌的基因簇［9，10］，产核糖霉素的核糖苷链霉菌的基因簇［11］等。目前国内、外对依纽小单孢菌基因簇的研究报道得不多，而西索米星又是一个对人类健康极其重要的抗生素，因此克隆研究参与西索米星生物合成基因及其基因组的排列和调控机制等非常必要。

    本研究继从依纽小单孢菌克隆到西索米星抗性基因srm1(AY661430)、西索米星糖基转移酶基因sisZ(DQ250994)和蟹肌醇合成酶基因sisB(DQ250993)后，又从依纽小单孢菌克隆到一个参与西索米星生物合成的基因——糖基转移酶2基因silD(GenBank登记号为DQ250992)。本文报道糖基转移酶基因2 silD的克隆表达及其核苷酸、氨基酸序列等。

    1  材料和方法

    1.1  材科

    1.1.1  菌种与质粒  伊纽小单孢菌(M.inyoensis)TS388由福州大学提供；大肠埃希菌BL21(DE3)、大肠埃希菌DH5a和质粒pUC18均由上海来益生物药物研发中心提供；表达载体为pET30a购自Novagen公司。其它常用化学药品及试剂购自上海生物工程公司和华美公司。

    1.1.2  培养基  LB培养基［12］根据需要添加氨苄西林(终浓度100mg/ml)和卡那霉素(终浓度50μg/ml)；用于伊纽小单孢菌TS388生长的培养基见文献［13］。

    1.1.3  主要试剂  所有工具酶购自TaKaRa公司；氨苄西林(ABPC)和卡那霉素为华美生物工程公司产品；琼脂糖为Pharmacia产品；PCR引物由上海生物工程公司合成；DNA序列由TaKaRa公司测定。

    1.2  DNA操作和基因silD克隆及其测序

    伊纽小单孢菌TS388染色体DNA的提取参照文献［13］；质粒DNA采用碱裂解法提取［12］，DNA酶切、连接等均按产品说明书进行；采用CaCl2方法制备感受态细胞，在含有抗生素的选择性培养基上筛选阳性转化子。DNA采用试剂盒回收(购自TaKaRa公司)。

    从GenBank中选择与伊纽小单孢菌亲缘关系比较接近的、产庆大霉素的棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)的庆大霉素生物合成基因簇中的糖基转移酶基因gntD作为引物设计的参考模板(AY524043)，设计一对简并引物，正向引物为：GAGAATTCATGGGCGGCATGCACGT(EcoRI)；反向引物为：ACCTGCAGCGGTCATCTCAGGACTC(PstI)。PCR循环条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，64℃复性1min，72℃延伸2min，循环30次；最后72℃保温10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收，克隆到pUC18载体上，阳性克隆子被命名为pLYsilD，并送TaKaRa公司测序，所得序列应用vector NTI 9.1和Blast软件进行序列比对和结构预测。

    1.3  融合蛋白表达载体的构建及分析

    提取阳性克隆子pLYsilD和pET30a质粒，分别经EcoRIHindIII双酶切，分离回收silD片段和pET30a载体，经酶切连接、转化，挑单个阳性克隆(大肠埃希菌BL21::pETsilD)到添加卡那霉素的LB培养基中，取1ml菌液加入到含50ml的LB中，培养到A600为0.6～0.8后加入IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导0～4h，取50μl菌液，加2×SDS蛋白上样缓冲液混合，沸水中煮沸5min，冰上放置5min，然后于15000r/min离心1min，沉淀收集到管底，取上层样品液20μl进行SDSPAGE电泳检测。

    2  结果与讨论

    2.1  重组子的构建和克隆

    引物设计策略。从GenBank基因库查找已公布的有关抗生素生物合成的相关基因或基因簇，经比较后选择与依纽小单孢菌亲缘关系比较接近的、产庆大霉素的棘孢小单孢菌的庆大霉素生物合成基因簇中的糖基转移酶基因gntD作为引物设计的参考模板，设计简并引物(1.2)，通过改变PCR复性温度，得到了目的片段(1181bp)，命名为silD。silD的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果见Fig.1。

    设计了不同的复性温度梯度进行PCR尝试，找到了适合扩增目标片段的合理温度为64℃～68℃(Fig.1中Lane 4～6)，不加exTaq酶作对照。

    从Fig.1可以看出，采用该策略设计的简并引物，    Lane 1: DL2000 marker;  Lane 2～8: the PCRproducts;

    Lane 2 60.0℃, Lane 3 61.6℃, Lane 4 64.1℃, Lane 5 65.5℃,

    Lane 7 68.1℃;  Lane 8: the PCRproducts (without exTaq,

    control, 65.0℃);  Lane 9: λDNA/HindIII marker

    Fig.1    The electrophoresis of PCRproducts from

    genomicDNA of Micromonospora inyoensis

    经PCR扩增，得到了比较理想的单一条带(1181bp)，说明该简并引物的设计策略和探索的扩增条件是合理可行的。

    PCR扩增获得的DNA(silD)片段经琼脂糖凝胶电泳分离，回收，经相应的限制性酶(EcoRIPstI)切割，并与被同样双酶切的pUC18载体进行连接，然后转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,构建含silD扩增片段的亚克隆子，经蓝白斑筛选，得到了阳性克隆子，命名为pLYsilD。

    2.2  重组质粒pLYsilD的鉴定及其分析

    将2.1获得的pLYsilD阳性克隆子经EcoRIPstI双酶切、EcoRI单酶切和PstI单酶切电泳检测，初步确认其阳性克隆子是目标克隆子(酶切电泳检测结果见Fig.2，外源DNA片段silD的限制性酶切位点见Fig.3)。经测序，pLYsilD的DNA序列总长为1181bp，对应于ORF的氨基酸序列为390aa。

2.3  基因silD的核苷酸序列在核苷酸水平的比较不重要应简略及其氨基酸序列分析

    来自伊纽小单孢菌的扩增DNA片段(EcoRIPstI)总长1181bp。借助vector NTI软件寻找开放性阅读框(ORF)，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，其orf总长1173bp(1～1173bp)。根据silD基因与gntD所具有的高度同源性，并参照gntD基因的研究结果，认为silD基因是依纽小单孢菌生物合成基因簇中的合成西索米星的重要基因：糖基转移酶基因2。基因silD的核苷酸序列、氨基酸序列等详细情况可登录GenBank查找(DQ250992)。

    silD表达的蛋白由390个氨基酸(aa)组成，其蛋白分子质量约为43.04ku，等电点为6.46。对silD密      plasmids pLYsilD by restriction endonuclease digestion.

    Lane 1: DL2000 marker;  Lane6: λDNA/HindIII marker;

    Lane 2: pLYsilD digested by EcoRIPstI;

    Lane 3: pLYsilD digested by EcoRI;

    Lane 4: pLYsilD digested by PstI;

    Lane 5: pUC18 digested by EcoRIPstI (control)

    Fig.2    Electrophoresis Gel analysis of the recombinant

    Fig.3    Gene silD and its restriction endonuclease site

    码子序列来说，其G和C在密码子的第1、2和3位置的使用率分别为70.8%，39.2%和93.1%，silD基因G+C的含量为67.6%，与gntD基因的68.5%非常接近。该基因的GC含量略低于小单孢菌类DNA中G+C含量的平均值71%～73%。

    2.4  silD基因的DNA序列及其氨基酸序列比对

    基因silD DNA比对击中8个分子，排在前2位的是与氨基糖苷类抗生素生物合成基因簇有关的，且同源性比较高，它们依次是：①产庆大霉素的绛红色小单孢菌中的基因簇，同源性94%(Micromonospora echinospora ATCC 15835 gentamicin biosesynthesis；AY524043)；②产妥布霉素的黑暗链霉菌的基因簇，同源性84%(Streptomyces tenebrarius tobramycin biosesynthetic gene cluster；AJ579650)。其余同源性较低的不一一说明。总之，从比对结果可以确定silD基因是依纽小单孢菌中控制西索米星生物合成的糖基转移酶基因。国内、外未见报道从产西索米星的依纽小单孢菌中克隆到这样的糖基转移酶基因，这是继从依纽小单孢菌中克隆到西索米星高抗性基因srm1(AY661430)等之后，从产西索米星菌中克隆到与西索米星生物合成有关的又一新基因。

    预测的氨基酸序列与gntD的氨基酸序列的比对，其同源性为98.2%。

    2.5  pETsilD克隆子的构建

    提取pLYsilD亚克隆质粒，经EcoRIHindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离，回收1199bp的DNA片段，并与被同样双酶切的pET30a载体进行连接，然后转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞，经卡那霉素抗性筛选得到了阳性克隆子，命名为pETsilD。pETsilD的EcoRIHindIII双酶切(Lane 2)、EcoRI单酶切(Lane 3)和HindIII单酶切(Lane 4)的电泳鉴定结果见Fig.4。

    2.6  基因silD表达蛋白的检测

    将以上利用原核表达载体pET30a构建含silD基因的融合表达载体(pETsilD)，转化到大肠埃希菌BL21(DE3)菌株，IPTG诱导，silD基因蛋白得到正常表达，表达蛋白的SDSPAGE电泳检测结果见Fig.5，检测结果表明silD基因能在大肠埃希菌BL21(DE3)中实现表达。

    从Lane 7没有检测到表达蛋白，说明表达蛋白停留在胞内，没有分泌到细胞外。

    3  结论

小单孢菌作为生物代谢产物合成药物的重要来源，已越来越受到人们的重视，揭开西索米星生物合成及其调控机制，对该类物种的改良开辟了新途径。采用    Lane 1: pETsilD no induced by IPTG (control);PCR技术，已从伊纽小单孢菌的染色体DNA扩增到四个特定的DNA片段，本次克隆到的DNA片段长1185bp，被命名为silD，经计算机分析和Blast比对得知，序列内含有一个ORF，编码390aa(43.04ku)的多肽链。基因silD属西索米星生物合成基因簇中的糖基转移酶2基因。该DNA片段先后依次被克隆到pUC18筛选载体和表达载体pET30a上，并在大肠埃希菌BL21(DE3)::pETsilD中实现表达。基因silD的碱基序列与来自棘孢小单孢菌的gntD的碱基序列的同源性高达94%。预测的SilD蛋白序列与GntB的同源性为98%。基因silD是从依纽小单孢菌克隆到参与西索米星生物合成的又一新基因。该基因在GenBank的接受号为DQ250992。基因silD的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

作者：洪文荣 曾志红 朱春宝 陈代杰 朱宝泉《中国抗生素杂志》

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