【摘要】 目的 分析南昌大学一附院ICU常见菌的种类、分布、耐药性及鲍曼不动杆菌(AB)质粒上的耐药基因。方法 用Microscanautoscanφ型自动微生物分析仪鉴定到种并测定其对常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC50)，按美国临床实验室标准委员会(NCCLS)2003年版标准判断结果，利用WHONET 5.2软件进行统计和分析，并用聚合酶链式反应(PCR)分析AB质粒上的耐药基因。结果 ICU分离菌中革兰阴性菌占75.3%，常见的菌种有铜绿假单胞菌(16.27%)、金葡菌(15.66%)、AB(15.06%)和肺炎克雷伯菌(14.66%)，非发酵菌的分离率明显上升，占分离菌总数的42.77%，87.35%的标本来自痰液。革兰阴性菌耐药率高，AB对包括IPM在内的13种常用抗生素均高度耐药且其质粒上携带可接合传递并稳定传代的三种耐药基因。结论细菌的多重耐药日趋严重，开展细菌耐药性监测，对指导临床合理使用抗生素，降低医院感染率和病死率有重要意义。质粒上带一种或多种可接合传递并稳定传代的blaTEM1(EU022370)、blaPER1(EU022369)和blaOXA23(EU022368)基因是ICU AB多重耐药的分子学机制之一。
【关键词】 ICU； 鲍曼不动杆菌； 耐药； 基因； 质粒
ABSTRACT Obejective To investigate the species, distribution and drug resistance of isolates obtained from ICU of the first affiliated
KEY WORDS ICU; Acinetobacter baumannii; Drugresistant; Gene; Plasmid
随着抗生素的泛用和滥用，越来越多的细菌产生耐药［1］，耐药性不断增强且播散迅速，甚至出现多重耐药，这已成为一个全球性问题［2］。耐药菌感染导致患者住院时间延长，费用增加，医院感染发病率和病死率增高［3］，尤其对儿童、老人、慢性病患者和免疫功能低下者，特别是对ICU患者［4］的生命危害更大。对ICU感染常见菌的种类、分布、耐药性进行分析，研究MDR AB质粒上的耐药基因型，有助于指导ICU的临床治疗，促进ICU感染的恢复。在ICU，AB不断增加［5］，许多AB菌株对β内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗生素高度耐药［6］。MDR AB是近些年造成ICU感染治疗困难的一个重要致病菌，因此，我们分析了ICU常见菌的种类、分布及耐药特点，并对AB质粒上的耐药基因进行了分型，探讨了其质粒在院内感染耐药传递中的重要作用。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
2004年5月～11月南昌大学一附院检验科保存的ICU菌株共166株。
1.2 药敏试验
用Microscanautoscanφ型自动微生物分析仪通过微量稀释法直接报告临床分离菌对常用抗菌药物的MIC50，按美国临床实验室标准委员会(NCCLS)2003年版标准判断结果，大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853(江西省临检中心)作药敏实验质控菌；大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作PCR实验对照(北京协和医院王辉教授惠赠)。
1.3 扩增引物
TEM1、PER1、SHV1、VEB1、OXA10、OXA23、OXA24和SHV型基因扩增引物按文献［7］，由TaKaRa公司合成。
1.4 试剂
质粒DNA小量纯化试剂盒，Ex TaqTM Hot Start Version购自TaKaRa公司，氨苄西林购自上海Sangon，LB培养基为英国OXOID公司产品。
1.5 PCR扩增AB耐药基因
PCR反应总体积50μl，其中引物各1μl，10×PCR(Mg2+)缓冲液5μl，dNTP 4μl，Taq酶0.25U，DNA模板2μl。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
1.6 接合试验
选择一株同时带blaTEM1、blaPER1和blaOXA23基因且对实验所用抗生素全耐药的MDR AB作供体菌，大肠埃希菌ATCC25922作受体菌，进行接合试验，挑单个接合子菌落在ABPC和ABPC的平板上各连传三代，鉴定菌种，分析其产酶、药敏、基因型及传代的稳定性。
1.7 数据分析
药敏结果用WHO全球细菌耐药性监测网提供的WHONET5.2软件进行统计分析。
2 结果
2.1 细菌分布
(1)菌种分布 在ICU分离的166株细菌中，革兰阳性菌41株，占24.7%，革兰阴性菌125株，占75.3%。在革兰阳性菌中最常见的是金葡菌26株(15.66%)，其次为屎肠球菌6株(3.61%)等。在革兰阴性菌中最常见的是铜绿假单胞菌27株(16.27%)，其次为AB 25株(15.06%)、肺炎克雷伯菌24株(14.46%)及嗜麦芽寡养单胞菌9株(5.42%)等。其中，非发酵菌的分离率近年来呈上升趋势，占ICU分离细菌总数的42.77%。
(2)标本分布 ICU分离的166株致病菌中痰液中分离的最多，有145株(87.35%)；其次为血液15株(9.04%)。
2.2 ICU常见菌的耐药状况
金葡菌仅对万古霉素敏感性高；革兰阴性菌耐药率高，肺炎克雷伯菌仅对亚胺培南敏感，但AB对包括亚胺培南在内的13种常用抗生素均耐药，嗜麦芽寡养单胞菌仅对环丙沙星敏感。各常见菌对临床常用抗生素的耐药率见表1。
2.3 AB质粒上的耐药基因型
25株AB中有22株耐药，其中15株质粒上带有耐药基因，共分离到3种耐药基因型，1株仅带blaTEM1基因，1株仅带blaOXA23基因，7株同时带blaTEM1和blaOXA23基因，6株同时带blaTEM1(840bp)、blaPER1(925bp)和blaOXA23(1003bp)基因， 基因序列已登录 表1 ICU常见菌的耐药率 NCBI genebank(EU022368EU022370)，基因分型图见作者的其它文章［7］。
2.4 MDR AB接合试验结果
(1)供体菌、受体菌和接合子的药敏 实验结果表明，供体菌质粒上所带的对复方磺胺甲口恶唑、氨苄西林、头孢噻吩、头孢泊肟、头孢呋肟、亚胺培南和氨苄西林/舒巴坦的耐药性传给了受体菌，使得接合子对这些抗菌药物耐药或中度敏感(表2)。
(2)供体菌和接合子的耐药基因型 用blaTEM1、blaPER1和blaOXA23三对引物分别扩增供体菌和接合子质粒上的耐药基因，结果表明接合子带有与供体菌相同的blaTEM1、blaPER1和blaOXA23三种基因(图1)。
(3)接合子的传代稳定性 接合子质粒上所携带的blaTEM1、blaPER1和blaOXA23三种耐药基因在AMPC和AMPC麦康凯培养基中均能稳定传代。
3 讨论
ICU患者长期住院、大量使用广谱抗菌药物、经 表2 供体菌、受体菌和接合子的药敏(MIC)实验结果
鲍曼不动杆菌大肠埃希菌25922接合子哌拉西林>64<8**<8**头孢曲松>32<4**<4**头孢他啶>16<8**<8**头孢吡肟>16<2**<2**头孢唑肟>32<4**<4**氨曲南>16<8**<8**庆大霉素>8<1**<1**阿米卡星>32<2**<2**妥布霉素>8<1**<1**哌拉西林/三唑巴坦>64<8**<8**环丙沙星>2<1**<1**亚胺培南>8<4**8*氨苄西林/舒巴坦>16<8**16*复方磺胺甲口恶唑>2<2**>2 氨苄西林>16 4**>16 头孢噻吩>16<8**>16 头孢泊肟>1<1**>1 头孢呋肟>16<4**>16
*：中敏； **：耐药。 1：GeneRulerTM DNA Ladder； 2：肺炎克雷伯ATCC700603
SHV引物PCR结果(阳性对照)； 3：大肠埃希菌ATCC25922
SHV引物PCR结果(阴性对照)； 4～6：依次为接合子blaTEM、
blaPER和blaOXA23引物PCR结果
图1 接合子的耐药基因分型图谱
常接受静脉插管、尿道插管和呼吸机辅助呼吸等侵入性治疗，发生全身感染的机会增加；ICU院感率为其它科室的5～10倍［8］，感染耐药菌的机会高2～3倍。
AB是引起ICU感染爆发的一种机会致病菌。是院内菌血症、肺炎和尿路感染的一个重要源泉［9］。MDR AB的报道逐年增加，常对广谱头孢菌素和碳青霉烯类耐药。
本研究发现，南昌大学一附院ICU感染最常见的致病菌为铜绿假单胞菌，占16.27%，其次为金葡菌(15.66%)、AB(15.06%)和肺炎克雷伯菌(14.46%)等。痰液中分离得最多，占87.35%，这与ICU患者长期使用呼吸机辅助呼吸密切相关。万古霉素为金葡菌感染治疗的首选药，与其它文献报道一致；革兰阴性菌耐药率高，亚胺培南为治疗肺炎克雷伯菌感染的首选药；但AB对包括亚胺培南在内的13种常用抗生素均耐药，对亚胺培南的耐药率高于其它地区报道［8］。头孢吡肟、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星和阿米卡星对治疗铜绿假单胞菌感染效果好，嗜麦芽寡养单胞菌仅对环丙沙星敏感。
目前国内、外在AB中分离的由质粒介导的β内酰胺酶主要为TEM1型，PER1型ESBLs和OXA23型碳青霉烯水解酶，且分离率极低。本研究在耐药AB质粒上分离到TEM1型和PER1型两种ESBLs基因，以及OXA23型碳青霉烯水解酶基因，有的同时带blaTEM1、blaPER1和blaOXA23三种基因，应进一步监测其流行和耐药情况，及时调整抗生素的使用方案，以防多重耐药AB感染。
接合是不同种属细菌间DNA自然传递的最常见方式，革兰阴性杆菌耐药率增长的最重要机制是带耐药基因的质粒通过接合播散。本研究证明了AB所带的多重耐药质粒可在不同种属间通过接合的方式进行传递，并可稳定传代，与Joshi等［10］报道相符。 以上结果提示，不同医院的ICU，抗感染所使用的抗生素不同，常见致病菌的种类及耐药谱也会有所不同，碳青霉烯为治疗严重细菌感染的最有价值的方法，但碳青霉烯耐药AB也逐渐增多；对ICU感染常见菌的种类、分布、耐药性进行分析，研究MDR AB质粒上的耐药基因型并确定其在不同种属细菌间的可传递性，有助于指导ICU感染的治疗。
作者：李蓉 李文林 石小玉 廖晚珍 徐小文 赵林《中国抗生素杂志》
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