【摘要】 目的 评价几种β内酰胺类抗生素对不同的产超广谱β内酰胺酶(ESBL)肺炎克雷伯菌动物肺炎模型的疗效。方法选择临床分离的2株对实验用抗生素敏感的产ESBL肺炎克雷伯菌建立小鼠肺炎模型。根据细菌分为GX6998和Tian 29两组，于感染后6h给药。对照组腹腔注射生理盐水0.5ml；治疗组分别给予头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦。连续治疗72h后，根据细菌计数结果评价疗效。结果 体外药敏试验表明Tian 29对4种抗生素的MIC值均大于GX6998，但仍在敏感范围内。4种抗生素治疗后，各组病死率均显著减低。GX6998组中4种抗生素均可显著降低肺组织匀浆的细菌计数(P<0.01)。Tian 29组中头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶可以显著降低肺组织匀浆的细菌计数(P<0.05)；头孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦也可使组织匀浆的细菌计数减少，但与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。比较同一种抗生素对2株细菌的清除作用发现，4种抗生素对GX6998的清除作用均强于Tian 29(P<0.01)。结论 体外敏感的广谱β内酰胺类抗生素和β内酰胺酶抑制剂复合制剂治疗产ESBL肺炎克雷伯菌感染均可显著降低动物模型的死亡率，减少肺组织匀浆细菌计数。但如果细菌对抗生素的MIC升高，将会影响治疗效果。
【关键词】 超广谱β内酰胺酶； β内酰胺类抗生素； 肺炎克雷伯菌； 药效学
ABSTRACT Objective To evalsuate the efficacy of several βlactams against ESBL producing Klebsiella pneumoniae pneumonia in a mouse model of peneumonia. Methods Two clinical Klebsiella pneumoniae strains susceptible to the experimental antimicrobial agents, Klebsiella pneumoniae GX6998 and Tian 29, were divided into two groups for mouse pneumonia infection respectively. After sixhour infection, mice were intraperitoneally injected with 0.5ml 0.9% NaCl for control; mice were intraperitoneally injected with ceftazidime, cefepime, cefoprazone plus sulbactam and piperacillin plus tazobactam respectively for trial. Seventytwo hours later, therapy efficacies were evalsuated with bacterial counts. Results All the trial groups had significantly lower mortality than control groups (P<0.05). Compared with the control groups, in GX6998infected groups, the bacterial amounts with all the testing agents were significantly decreased (P<0.01); in Tian 29infected group, the bacterial amounts with cefoprazone plus sulbactam and ceftazidime were significantly decreased (P<0.05); in cefepime and piperacillin plus tazobactam groups, bacterial amounts were reduced without significant difference with that of the control group (P>0.05). Conclusion The combinations of broadspectrum βlactams and βlactamases inhibitor could reduce the mortality and bacterial amountsin mouse pneumonia model which were susceptible to ESBLsproducing Klebsiella pneumonia strains. However, the clinical efficacy would be reduced when the MIC increased.
KEY WORDS Extended spectrum βlactamases; βLactams Klebsiella pneumonia; Pharmacodynamics
肺炎克雷伯菌是院内下呼吸道感染的主要致病菌。我国院内感染的肺炎克雷伯菌43%为产超广谱β内酰胺酶(ESBL)菌株［1］。感染产ESBLs肺炎克雷伯菌患者的预后明显较感染不产ESBLs肺炎克雷伯菌患者差［2］，能否使用广谱β内酰胺类抗生素治疗此类感染一直存在争议。本研究通过小鼠肺炎模型评价几种临床常用的广谱β内酰胺类抗生素和酶抑制剂复合制剂对产ESBLs肺炎克雷伯菌动物肺炎的疗效。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)观察药品 头孢他啶(Glaxo Smithkline公司，批号C076348，纯度89.4%)；头孢吡肟(BristalMyers Squibb公司，批号0505793，纯度88.6%)；头孢哌酮/舒巴坦(Pfizer公司，批号45839147，纯度96.6%)；哌拉西林/三唑巴坦(Wyeth公司，批号A56167，纯度88.6%)。
1.2 实验菌株
使用临床分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌GX6998和Tian 29建立肺炎模型，菌株来自国家食品药品监督管理局细菌耐药性监测中心。ESBLs表型确证试验按CLSI/NCCLS(2002年)标准纸片扩散法操作。
1.3 实验动物
雄性昆明种小白鼠，体重(25±2)g，购自中国医学科学院动物研究所。
1.4 产ESBL肺炎克雷伯菌最小抑菌浓度(MIC)测定
细菌MIC的测定采用CLSI/NCCLS(2002年)推荐的微量肉汤稀释法，使用大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作为质控菌［3］。
1.5 建立肺炎模型
将菌株密集划线于MH培养基上，
实验小鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛(0.4ml/g)麻醉，自颈部正中切开皮肤，钝性分离直至暴露气管。用1ml注射器将30μl菌悬液经气管缓慢注入后将小鼠直立摇晃3min，使细菌尽量均匀分布于两肺。
1.6 动物分组及给药方案
将小鼠随机分为两组，分别接种肺炎克雷伯菌GX6998和Tian 29。两组内再根据治疗措施不同分为对照组和头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦4个抗生素组。治疗开始于接种细菌后6h，对照组每8h腹腔注射生理盐水0.5ml；4个抗生素组分别每8h腹腔注射头孢哌酮/舒巴坦200mg/kg、头孢他啶200mg/kg、头孢吡肟200mg/kg，每6h腹腔注射哌拉西林/三唑巴坦120mg/kg，以上方案连续应用3d后统计各组的病死率。之前的药动学实验表明，此给药方案可以保证4种抗生素的血清药物浓度大于肺炎克雷伯菌GX6998 MIC值的时间超过给药间隔的40%。
1.7 细菌计数测定
各组分别于治疗前及治疗后24、48和72h(最后一次给药后4h)各时间点将小鼠处死后充分放血，取双肺，冰生理盐水冲洗3次，置于玻璃匀浆器中加入2ml生理盐水研磨15min，制成肺组织匀浆。10倍倍比稀释肺组织匀浆，依次取各浓度100μl接种于MH琼脂培养基上，
1.8 统计学分析
采用SPSS11.5统计软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，组间两两比较应用q检验，计数资料采用卡方检验，P<0.05认为有显著性差异。
2 结果
2.1 MIC测定结果
Tian 29对4种抗生素的MIC值均大于GX6998，但仍在敏感范围内(表1)。
2.2 病死率比较
两组中，头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟以 表1 2株细菌对4种抗生素的MIC值(mg/L)以头孢哌酮的标准判读此结果。
及哌拉西林/三唑巴坦治疗后与对照组比较病死率显著降低。各抗生素组间病死率比较无显著差异(表2)。
2.3 细菌计数结果
(1)4种抗生素对GX6998感染的疗效比较 治疗72h后，4种抗生素都可以显著降低肺组织的细菌量(P<0.01)；治疗前后细菌计数的差值与对照组比较均有显著性差异(P<0.01)；各抗生素组间比较无显著性差异(表3)。表2 4种抗生素治疗2株细菌感染的病死率比较表3 4种抗生素对GX6998杀菌作用比较 *：与治疗前比较P<0.01； **：与对照组比较P<0.01。
(2)4种抗生素对Tian 29感染的疗效比较 治疗72h后，头孢哌酮/舒巴坦和头孢他啶可显著降低肺组织的细菌量，治疗前、后细菌计数的差值与对照组比较有显著性差异(P<0.05)；头孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦治疗72h后细菌计数有所减少，但和治疗前比较无显著性差异，治疗前、后细菌计数的差值与对照组比较也无显著性差异(表4)。
(3)同一抗生素对2株细菌感染的疗效比较 比较两组中每一种抗生素治疗前后肺组织细菌计数的差值发现，4种抗生素对GX6998的清除作用均强于Tian 29(表5)。 表4 比较4种抗生素对Tian 29杀菌作用表5 比较4种抗生素对2株菌的杀菌作用
3 讨论
本研究通过观察4种临床常用的广谱β内酰胺类抗生素治疗产ESBLs肺炎克雷伯菌导致的小鼠肺炎，发现4种抗生素均对MIC值较低的细菌GX6998清除作用较好；对细菌Tian 29清除作用较差，即使Tian 29对这些抗生素也敏感，提示即使广谱β内酰胺类抗生素对产ESBLs肺炎克雷伯菌敏感，随着MIC值的升高其治疗效果也会逐渐减弱。
广谱β内酰胺类抗生素因为对产β内酰胺酶和广谱β内酰胺酶的革兰阴性菌治疗效果良好，一直被广泛应用于临床。研究发现，广谱β内酰胺类抗生素治疗敏感的产ESBLs细菌感染往往不能达到预期的效果，其治愈率和生存率明显低于碳青霉烯类、头霉素类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药物，所以不建议用于治疗产ESBLs细菌导致的感染［4］。
目前认为β内酰胺抗生素治疗产ESBLs细菌感染失败的主要原因之一是接种量效应。肠杆菌科细菌对所有的β内酰胺类抗生素均有不同程度的接种量效应，其中头孢吡肟最明显［5］。但是接种量效应并不能说明使用β内酰胺类抗生素治疗一定无效。Maglio等［6］在实验中选择了多株产ESBLs大肠埃希菌建立动物感染模型，虽然体外实验也表现明显的接种量效应，但体内实验发现感染部位105和107CFU/ml细菌量对于头孢吡肟的治疗效果并没有影响。ThanvinEliopoulos等用哌拉西林/三唑巴坦和头孢吡肟治疗产ESBL的肺炎克雷伯菌大鼠腹腔脓肿模型，也得到相同的结果［7］。两项研究均表明，血清药物浓度大于药物对细菌的MIC的时间(% T>MIC)是判断β内酰胺类抗生素抗感染疗效的有效指标。
本实验选择了2株对4种抗生素都敏感的产ESBL肺炎克雷伯菌建立肺炎模型，结果显示，在GX6998组中4种抗生素都可以明显减少肺组织的细菌计数；在Tian 29组中，头孢哌酮/舒巴坦和头孢他啶也可以显著减少肺组织的细菌计数；头孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦虽然可以使细菌计数有一定的减少，但和对照组比较没有显著性差异；4种抗生素在GX6998组中的细菌清除的效果均好于Tian 29组。这是由于β内酰胺类抗生素属时间依赖性抗生素，要达到理想的治疗效果，要求采取的给药方式能够使% T>MIC不少于40%～50%给药间隔时间［8］。本次实验同时进行的药物浓度检测结果，由于4种抗生素对Tian 29的MIC升高，使此组中4种抗生素的% T>MIC小于40%，甚至不到30%。
我们的实验表明使用体外敏感的广谱β内酰胺类抗生素和β内酰胺酶抑制剂复合制剂治疗产ESBL肺炎克雷伯菌感染，可以明显降低动物模型的死亡率，可以显著减少肺组织匀浆活菌计数。但如果细菌对抗生素的MIC升高，即使仍在敏感范围内，仍将影响治疗效果，甚至导致治疗失败。
分析以往的临床研究发现，随着MIC值降低，敏感的广谱β内酰胺类抗生素治疗产ESBL细菌感染的失败率逐渐减低［4，9］。目前，随着碳青霉烯类、头霉素类抗生素应用增多，产ESBL细菌对它们的耐药情况逐渐加重。产ESBL细菌常携带多种耐药基因，同时对氟喹诺酮类和/或氨基糖苷类抗菌药物耐药［10］，这样大大限制了临床用药的选择，给治疗带来困难。所以我们认为不应该完全限制广谱β内酰胺类抗生素应用于此类感染，而是根据广谱β内酰胺类抗生素的药动学特点和对产ESBL肠杆菌科细菌的MIC选择用药。这就需要更多的大规模的临床研究来评价此类抗生素治疗产ESBL细菌感染的临床疗效。
作者：裴迎华 张杰 马越 李景云 《中国抗生素杂志》
【参考文献】
［1］ 王辉，陈民钧，倪语星，等. 2003～2004年中国十家教学医院革兰阴性杆菌的耐药分析［J］. 中华检验医学杂志，2005，28(12)：1295～1303.
［2］ Tumbarello M, Spanu T, Sanguinetti M. Bloodstream infections caused by extendedspectrumβlactamaseproducing Klebsiella pneumoniae: risk factors, molecular epidemiology, and clinical outcome ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2006,50(2):498～504.
［3］ National Committee for Clinical Laboratory Standard. Performance standard for antimicrobial susceptibility testing M 100S 9 ［S］. Wayne Pennsylvania: NCCLS,2002.
［4］ Paterson D L, Ko W C, Von Gottberg A, et al. Outcome of cephalosporin treatment for serious infections due to apparently susceptible organisms producing extendedspectrumβlactamases: implications for the clinical microbiology laboratory ［J］. J Clin Microbiol,2001,39(6):2206～2212.
［5］ Thomson K S, Moland E S. Cefepime, piperacillintazobactam, and the inoculum effect in tests with extendedspectrum βlactamaseproducing Enterobacteriaceae ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2001,45(12):3548～3554.
［6］ Magilo D, Ong C, Banevicius M A, et al. Determination of the in vivo pharmacyodynamic profile of cefepime against extended spectrum beta lactamase producing Escherichia coli at various inocula ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2004,48(6):1941～1947.
［7］ ThauvinEliopoulos C, Tripodsi M F, Moellering R C Jr, et al. Efficacies of piperacillintazobactam and cefepime in rats with experimental intraabdominal abscesses due to an extendedspectrum βlactamaseproducing strain of Klebsiella pneumoniae ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1997,41(5):1073～1057.
［8］ Andes D, Anon J, Jacobs M R. Application of pharmacokinetics and pharmacodynamics to antimicrobial therapy of respiratory tract infections ［J］. Clin Lab,2004,24(2):477～502.
［9］ Kang C I, Kim S H, Park W B, et al. Bloodstream infections due to extendedspectrum βlactamaseproducing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae: risk factors for mortality and treatment outcome, with special emphasis on antimicrobial therapy ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2004,48(12):4574～4581.
［10］ Paterson D L, Bonomo R A. Extendedspectrum βlactamases: A clinical update ［J］. Clin Microbiol Rev,2005,18(4):657～686.
