【摘要】 目的 了解嗜麦芽寡养单胞菌的临床株H407和A26在抗菌药物诱导下耐药性和SmeDEF外排泵表达的变化。方法 比较有或无环丙沙星诱导时嗜麦芽寡养单胞菌H407和A26的MIC和EOP值，对在亚抑菌浓度环丙沙星中培育后的菌株smeD基因进行RT-PCR扩增，监测表达水平。结果 对抗生素敏感的H407和A26泵抑制呈阳性或阴性反应。2株菌经环丙沙星过夜孵育后测得的对氯霉素和环丙沙星MIC值比正常非诱导时的MIC值高1～3个稀释度；加泵抑制剂CCCP后，2个诱导株的MIC值均有明显下降。H407和A26经环丙沙星诱导后氯霉素的EOP分别有4.8和近4倍的增长。2株菌在抗菌药物过夜和指数期添加生长时smeD的mRNA明显高于无抗菌药物培养株。结论 2株嗜麦芽寡养单胞菌临床株在环丙沙星诱导下对部分抗菌药物的耐药性提高，与SmeDEF泵的诱导表达增加有关。
【关键词】 嗜麦芽寡养单胞菌； 外排泵； 耐药性； 诱导
ABSTRACT Objective To investigate changes of antibiotic resistance of the clinical isolates of S.maltophilia, and the repression level of efflux pump SmeDEF by the induction of antibiotics. Methods To examine the resistance profile of the clinical strains by agar dilution and the efficiency of plate (EOP) to antimicrobes, and their reactions to pump inhibitor CCCP, and to investigate the mRNA level of smeD by RT-PCR, in the presence or not of ciprofloxacin. Results The antibiotic-sensitive strains H407 and A26 were positive and negative to pump inhibitor respectively. MICs of ciprofloxacin and chloramphenicol induced by ciprofloxacin with sub-inhibition level were higher by 1～3 dilutions than those without induction. The incre-ases were inhibited by CCCP. After induction by ciprofloxacin, the EOP to chloramphenicol in H407 and A26 increased by 4.8 and nearly 4 times respectively, and the level of mRNA of smeD in the 2 antimicrobe-induced strains rose as well. Conclusion The resistance to several antimicrobes in the two isolates of S.maltophilia could be induced by ciprofloxacin. The possible antibiotic resistance mechanisms seemed likely by the mvolvement of the increased transcription level of smeDEF.
KEY WORDS Stenotrophomonas maltophilia; Antibiotic resistance; Efflux pump; Induction
嗜麦芽寡养单胞菌是机会致病菌，近10年来该菌所致的感染不断上升，已成为医院内感染的重要的致病菌之一，可引起身体多个部位的炎症及败血症，其中在下呼吸道感染的分离率高。嗜麦芽寡养单胞菌耐药性强，对临床使用的多数抗生素都具有耐药性［1，2］， 对部分抗生素甚至高度耐药。嗜麦芽寡养单胞菌内源性和获得性多重耐药机制可能与存在多重外排泵有关，已发现的外排泵SmeDEF对多种毒性物质和包括氟喹诺酮类的多种抗生素有外排作用［3］。研究显示SmeDEF的表达水平与该菌多重耐药程度有关。了解药物外排泵及其调控机制对于该菌多重耐药本质的认识和药物作用靶位的研究均有重要意义。目前对嗜麦芽寡养单胞菌外排泵SmeDEF表达调控机制的研究较少，发现SmeT蛋白对SmeDEF转录有阻遏作用。已有研究发现多药外排泵如大肠埃希菌AcrAB泵的表达能被胆盐和某些抗菌药物所激发，可能与感染时大肠埃希菌耐药表型的诱导有关［4，5］。外排系统调控机制复杂，是否在嗜麦芽寡养单胞菌中也有这样的诱导机制？本研究对嗜麦芽寡养单胞菌临床株在抗菌药物诱导下的表型和药物外排泵SmeDEF表达进行分析，探讨这些变化在耐药中所起作用。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)菌株来源 嗜麦芽寡养单胞菌临床株H407和A26分别来自感染者的痰与气管吸出物。铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922作药敏实验质量控制。
(2)抗菌药物和主要化学试剂 抗菌药物为氯霉素和环丙沙星；标准品购自北京天坛生物制品研究所。泵抑制剂CCCP为Sigma公司产品。培养基为LB肉汤、MH和LB琼脂，溴化乙啶(EB)为Sigma公司产品。SV Total RNA Isolation System、RT-PCR系统(Cat.#1260)和琼脂糖购自Promega公司产品。分子量标准DL-2000购自TaKaRa公司。
1.2 方法
(1)抗菌药物诱导和非诱导时的MIC值 取LB平皿上过夜生长的单菌落，分别接种于含环丙沙星(浓度为1/3MIC)的LB肉汤，孵育过夜；离心沉淀后重溶，多点接种于含和不含25μg/ml CCCP的环丙沙星和氯霉素的倍比稀释MHA平皿上，浓度105CFU/spot，
(2)抗菌药物诱导的菌株耐药性—平皿效率实验(EOP) H407和A26同时进行以下两组实验。一组取LB平皿上过夜孵育的菌落，105CFU/ml 2.5μl涂布于含氯霉素(浓度为0.8MIC)的MHA平皿和空白对照平皿。另一组在含环丙沙星(浓度为1/3MIC)的LB平皿过夜孵育的菌落，稀释后同样涂布于含氯霉素的平皿和空白对照平皿，
(3)检测诱导前后smeD表达(RT-PCR) 菌株H407和A26同时进行以下三组实验。一组在LB肉汤中，
以嗜麦芽寡养单胞菌β-内酰胺酶L2的基因blal2的258bp片段(引物：上游B1，下游B2)作为参照进行RT-PCR，RNA约0.5μg。
2 结果
2.1 实验菌株的耐药特性
H407和A26对抗菌药物耐药表型和一般特性列表2。其中H407对诺氟沙星、环丙沙星和氧氟沙星敏感，在使用泵抑制剂后MIC无变化；A26对以上几种药物也敏感，但在加泵抑制剂CCCP后对氯霉素的MIC值降至原值的1/4。药物敏感性变化见表3。
2.2 抗菌药物诱导和非诱导时的MIC值
H407和A26与环丙沙星过夜孵育后对氯霉素和环丙沙星MIC比正常非诱导时MIC高1～3个稀释度，其中A26经诱导后对环丙沙星和氯霉素的MIC分别增长3和2个稀释度，大于H407的2和1个稀释度。加泵抑制剂CCCP后，H407和A26诱导株的MIC均有明显下降，除A26诱导株被CCCP抑制后的氯霉表1 扩增反应使用引物表2 实验菌株的一般特性表3 H407和A26对环丙沙星诱导和非诱导时的素MIC降至无诱导时被抑制的水平(8μg/ml)，H407和A26诱导株加CCCP后的其余MIC均比无诱导时加或不加泵抑制剂的MIC值高，提示经环丙沙星诱导的菌株在抑制外排作用后对环丙沙星的耐药性明显下降，但未恢复至诱导前被抑制的敏感水平，甚至未达到无诱导时的敏感性。
2.3 抗菌药物诱导菌株的EOP结果
EOP是更为准确的测量不同菌群中耐药水平的方法。H407诱导前氯霉素的EOP值为0.075，环丙沙星诱导后的氯霉素EOP为0.28，显示有近4倍的增长。A26无环丙沙星诱导时氯霉素的EOP值为0.12，诱导后的EOP为0.57，显示耐药性增长了4.8倍(表3)。
2.4 抗菌药物诱导和非诱导株smeD的RT-PCR结果
H407和A26在亚抑菌浓度环丙沙星诱导后，smeD的mRNA水平增高，在3个RNA浓度下均可见添加抗菌药物的两组比对照组的RT-PCR条带亮度高，抗菌药物过夜组与指数期添加组的亮度无明显不同。作为对照的blal2 mRNA水平诱导前后无明显改变。图1、2为A26菌株smeD和blal2的RT-PCR电泳结果。
3 讨论
外排泵(efflux pump)作为一种抗菌药物耐药的机制，首先报道于20世纪80年代初。之后，在许多细 A、D、G：指数期添加组； B、E、H：抗菌药物过夜组；菌中发现外排泵介导的多重抗菌药物耐药，例如NorA、AcrAB、RobA、MexAB以及Bmr等［8～11］。有证据表明嗜麦芽寡养单胞菌的多重外排泵是其固有和获得性多重耐药的最重要原因。SmeDEF外排泵是嗜麦芽寡养单胞菌与耐药有关的重要的外排泵，SmeDEF的外排底物有喹诺酮类、四环素、氯霉素、大环内酯类等结构不相关的抗菌药物。Li等［12］实验中野生株ULA511的smeDEF低表达，野生株SmeDEF的耐药谱与高表达smeDEF的MDR突变株相同。Aloson等［13］发现仅部分嗜麦芽寡养单胞菌临床株的smeDEF有转录活性，存在活性SmeF。一般认为一些多重外排泵在细菌的正常生长代谢中起作用［14］，本研究室也证实smeDEF基因广泛存在于嗜麦芽寡养单胞菌临床株中，而且该基因的转录水平与菌株的耐药程度有关［7］。
已知决定外排泵活性大小的最常见因素是调控其表达的一些因子的变化，这些调控因子或作用对象的改变对耐药性变化的影响不完全一致。包括革兰阴性菌的多种致病菌中，多药外排系统的结构基因常在附近调控基因编码蛋白的严谨降调控下［4，15］，外排泵的高表达常常由于这些调控基因的突变所致。但有些外排泵的调控机制更为复杂，如调节大肠埃希菌Mar耐药的情况。与泵有关的耐药机制中，可因耐药调控有关的一些编码/非编码序列的改变［16，17］，或调控因子活性变化而使外排泵转录或翻译升高，而增加菌株的耐药性。
(1)SmeT的实验研究 SmeT是SmeDEF转录的阻遏子，SmeT蛋白属于TetR和AcrR转录抑制子家族。SmeT的编码基因660bp，位于smeD上游223bp，SmeT与SmeDEF反方向转录。smeDEF和smeT分别有单启动子PsmeDEF和PsmeT，两个基因启动子可能交互影响。Sanchez等［3］的研究中，SmeT在敏感菌株D457中低表达，而在耐药株D457R的表达水平高，SmeT可能同时降调控SmeT自身转录。SmeT在敏感菌中浓度有限，人为地增加其表达可进一步提高菌株敏感性。这可能是野生SmeT对SmeDEF外排泵本底表达的调控，使之在生理条件下起作用。
(2)诱导机制的研究 嗜麦芽寡养单胞菌外排泵SmeDEF的表达亦受到生长周期的调控，SmeDEF和SmeT的表达也可能以不同方式对环境和生理信号起反应［13］。除了生长相调控，嗜麦芽寡养单胞菌有否类似一些外排系统由水杨酸类似物等天然活化信号分子或抗菌药物底物激发，表达增加的机制？此前还未有嗜麦芽寡养单胞菌外排泵可被其底物诱导的报道。
通过检测嗜麦芽寡养单胞菌H407和A26(泵抑制阳性和阴性的敏感菌株)的MIC和EOP值，观察到在亚抑菌浓度的环丙沙星中生长后对抗菌药物的耐药性均有所提高，而且这种增加的耐药性均能在泵抑制剂作用下降低，但对泵抑制剂不敏感的H407未恢复至诱导前被抑制的敏感水平，甚至未达到无诱导时菌株的敏感性。所以，外排作用在这样的耐药水平增加中很重要，而且还有其它机制参与诱导后的耐药性增加。对mRNA水平监测发现环丙沙星诱导后SmeDEF泵的表达亦有显著增高，而在指数期抗菌药物作用1h已有明显的提高，说明诱导作用主要发生在转录调控方面，关于其它泵的诱导实验证实了这一机制［6］。这也可能解释在有的病例中，如环丙沙星等抗菌药物治疗过程中嗜麦芽寡养单胞菌耐药性增加的情况，以及在临床中发现的治疗与体外药敏实验结果不符的部分病例。
对诱导物和阻遏蛋白的作用，及与基因调控的研究已有很长时间，报道有些外排泵的底物如胆盐及多种药物有诱导外排泵表达的作用［5，18］。研究显示诱导作用可通过底物与外排泵的负调控子相互作用而实现［6，10］，或某些诱导作用通过与正调控子的作用。金葡菌QacA多重外排泵的负调控子QacR［19］，以及四环素外排泵TetA的负调控子TetR和大肠埃希菌多重外排泵EmrAB的EmrR，均直接参与诱导作用［10，11］。根据同族蛋白的变化，推测嗜麦芽寡养单胞菌的诱导过程：抗菌药物进入细菌体内后，直接或通过中间代谢产物，与阻遏蛋白SmeT结合，不是建立或断裂个体之间的键，而是改变蛋白形状，降低其与操作区的亲和力。两分子的诱导物结合于四聚体足以解除其抑制作用。诱导物的结合改变了帽相对于核心的方向，使得一个二聚体内的两个帽不再能同时结合DNA，消除了多聚的优点，降低了对操作区的亲和力，从而改变了阻遏蛋白在DNA链上的分布［20］。除了环丙沙星能诱导嗜麦芽寡养单胞菌耐药性的提高，应该还有其它一些外排泵底物或类似物可以作为诱导剂调节泵的表达水平。
(3)其他可能的机制 根据已知与泵有关的耐药机制的结论和本研究的结果，嗜麦芽寡养单胞菌临床株有关SmeDEF的耐药性除有诱导机制，还可能有非编码基因序列的变化引起结构基因smeD转录或翻译增强，或可能通过阻遏蛋白SmeT作用发挥所需的序列变化影响。本室前期研究发现耐药菌SmeT阻遏蛋白序列出现Asp218Glu氨基酸替换，以及125、136、138和148位氨基酸多个位点的替换。Sanchez等实验室检测序列分析证实SmeT的leu166Gln氨基酸突变导致了嗜麦芽寡养单胞菌D457R的蛋白活性下降。可能为影响蛋白的稳定性，SmeT抑制活性降低或失活。不同耐药机制单独或可能联合起作用，增加临床菌株与多重外排有关的耐药性。该菌对喹诺酮等抗菌药物的耐药性可能还有除了泵的其他机制，如还未得到证实的可能的靶酶突变［20］。
本研究仅就SmeDEF外排泵的底物诱导作用作一初步探讨，这些发现在国内、外尚属首次。嗜麦芽寡养单胞菌SmeDEF外排泵的调控机制很复杂，可能有众多的顺式和反式因子对表达起作用。有关嗜麦芽寡养单胞菌临床株SmeDEF外排泵的表达调控及与耐药性产生的具体机制还有待今后进一步明确。
作者：孙二琳 宋诗铎 祁伟 王玉宝《中国抗生素杂志》
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