【摘要】  研究比浊法测定硫酸多黏菌素E效价的影响因素和规律，建立了硫酸多黏菌素E的比浊法快速测定方法，检测时间由杯碟法的20h缩短到4h。当硫酸多黏菌素E的效价为30～100u/ml时，检测菌液接种浓度为5%，培养时间为4h，吸光度对数值与抗生素效价具有良好的线性关系。本法重现性好，相对误差小于5%。

【关键词】  硫酸多黏菌素E 比浊法 效价

    Fast determination of the potency of polymyxin E by turbidimetry assay

    ABSTRACT  A turbidimetry assay for fast determination of polymyxin E potency was developed by studying on the influencing factors. Compared with Oxford assay, turbidimetry assay decreased the determination time from 20 hours to 4 hours. There was a linear relationship between the potency of polymyxin E and the logarithm of absorbency in the range of 30～100u/ml and inoculating concentration was 5%, with 4hour culture time. The turbidimetry assay had a good reproducibility, and the relative error was less than 5%.

    KEY WORDS  Polymyxin E;  Turbidimetry assay;  Potency

     多黏菌素E(polymyxin E或colistin)是由多黏芽孢杆菌抗敌素变株(Bacillus polymyxin var.colistinus)经发酵培养生产的一种环状多肽类抗生素，它对革兰阴性杆菌有强烈的抑菌作用［1］。由于多黏菌素E具有高效、低毒、残留少的特性，将其硫酸盐制成兽药用于防治由大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌等革兰阴性菌［2］引起的肉鸡、猪、牛等畜禽的肠道疾病。目前采用杯碟法［3，4］测定其生物效价。杯碟法操作步骤复杂，耗时长，测定时间需要大约20h，不能快速反馈工业生产中各个阶段产品生物活性，必须开发一种快速测定硫酸多黏菌素E效价的方法。比浊法是抗生素效价微生物检定的方法之一［5～8］，其原理是将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培养基内，混匀后，经短期培养，测量培养物的吸光度，在一定线性范围内细菌培养物吸光度的对数值logA与抗生素的浓度成正比，比浊法具有检测快速的特点。本文深入研究了比浊法测定硫酸多黏菌素E效价的影响因素和规律，建立了硫酸多黏菌素E的比浊法快速检测方法。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    (1)检定菌  大肠埃希菌(CMCC(B)44102)购自微生物菌种保藏中心。

    (2)硫酸黏杆菌E素(硫酸多黏菌素E)标准品  中国兽医药品监查所提供，批号K02700902，效价19536u/mg。

    (3)主要仪器  752紫外分光光度计；恒温水浴振荡器；牛津杯(不锈钢，高100mm，外径8.0mm，内径6.0mm)；PHS3C精密pH计。

    1.2  方法

    (1)检定培养基的制备  称取蛋白胨8g，牛肉膏4g，酵母粉5g，磷酸氢二钾3.3g，磷酸二氢钾1g，氯化钠4.5g，葡萄糖2.5g，加蒸馏水至1000ml加热混匀，调节pH值为7.2，过滤，115℃灭菌30min。

    (2)检测菌液的制备  取大肠埃希菌的琼脂斜面培养物一支，加0.9%灭菌生理盐水1ml洗下菌苔转入茄瓶，37℃培养18～22h，用0.9%灭菌生理盐水15ml洗下菌苔，制成菌液，在分光光度计上波长为600nm处用0.9%灭菌生理盐水调节菌液吸光度值(A=2左右)，用此菌液分以2.5%、5%和10%的接种量接种至检定培养基作为检测菌液。

    (3)硫酸多黏菌素E标准溶液的配制  精确称取硫酸多黏菌素E标准品，用pH6.0的磷酸盐缓冲液稀释到600u/ml，再用水稀释成浓度分别为30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8种浓度的标准溶液。

    (4)比浊法吸光度测定  精密吸取1ml硫酸多黏菌素E溶液，加9ml检测菌液，放入恒温水浴摇床以200r/min转速37℃振荡培养一定时间，取出，立即用冷水冷却，摇匀，以9ml未接种检定培养基和1ml水混合液作参比，用分光光度计在600nm波长处［9］分别测定吸光度。

    (5)比浊法样品检测  将样品稀释到适当浓度后，按实验1.2.(4)中有关步骤操作测定吸光度，在吸光度对数效价标准曲线上查对应的效价，乘以稀释倍数，即得到样品的效价。

    2  结果与讨论

    2.1  检测条件的选择

    (1)大肠埃希菌生长曲线的测定  将大肠埃希菌菌液分别以2.5%、5.0%和10%的接种量接入检定培养基，37℃条件下以200r/min振荡培养，在600nm处每小时检测一次培养物的吸光度，结果如Fig.1所示。大肠埃希菌在自然状态下生长时延迟期一般为1h左右，这一时期菌体生长缓慢，菌量基本上维持在最低水平；然后进入指数期，这一时期大约持续7～8h，这一时期菌体生长速率常数最大，生长最迅速；9h以后进入稳定期，菌体总量保持不变。当菌体生长时间在2～4h，吸光度值达到0.4～1.0，处于最佳检测时期。

    Innoculating concentration: 1: 2.5%;  2: 5%;  3: 10%

    Fig.1    Cell growth curve of E.coli    (2)检测菌液接种浓度的选择  将接种浓度分别为2.5%、5.0%和10%的检测菌液按实验1.2.(4)培养2h，绘制吸光度效价曲线(Fig.2)。 由Fig.2可见，不同接种浓度的检测菌液对培养物的吸光度影响较大。当检测菌液接种浓度为2.5%时，由于初始接种量少，少量抗生素的存在能够完全抑制菌体的生长，菌体几乎不能生长；当检测菌液接种浓度为10%时，菌体生长很快，抗生素难以抑制菌体生长，不同浓度抗生素对菌体生长的抑制程度不明显；当检测菌液接种浓度为5%时，不同浓度抗生素对菌体生长的抑制程度区别明显，灵敏度高，因此5%接种浓度的检测菌液适合本法测定硫酸多黏菌素E效价。

    Innoculating concentration: 1: 2.5%;  2: 5%;  3: 10%

    Fig.2    Effect of different innoculating concentration

    on absorbency

    (3)培养时间的选择  接种浓度5.0%的检测菌液，按实验1.2.(4)分别培养2、3和4h，绘制吸光度效价曲线(Fig.3)。由Fig.3可见，在实验菌接种量固定在5%的条件下，增加培养时间，灵敏度提高显著。培养时间为2h，吸光度效价曲线比较平坦，灵敏度低，当培养时间增加为4h，不同浓度抗生素对菌体生长的抑制程度区别明显，灵敏度高，因此选择4h作为培养时间用于检测。

2.2  标准曲线的确立

    精密吸取30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8种硫酸多黏菌素E标准溶液各1ml，加9ml接种浓度为5%的检测菌液，放入恒温水浴摇床以转速200r/min 37℃培养4h，取出，立即用冷水冷却，摇匀，以9ml未接种检定培养基和1ml水混合液作参比，用分光光度计在600nm波长处分别测定吸光度，以硫酸多黏菌素E浓度为横坐标，吸光度对数值为纵坐标，绘制标准曲线(Fig.4)。

    将吸光度对数值对相应浓度进行线性回归，得到回归方程：

    lgA=-0.01039C+0.1837  r=0.9953

    可见硫酸多黏菌素E的浓度在30～100u/ml的范围内与吸光度对数值呈良好的线性关系。

    2.3  重现性测定

    用比浊法对3个不同规格的硫酸多黏菌素E样品进行重现性试验，检测4次结果见Tab.1，相对标准偏差在3%以内，重现性较好。

    2.4  正确性测定

    以杯碟法［10］测定效价数据为标准，得出本方法的准确度(Tab.2)；比浊法测定的相对误差在5%以内，符合药典规定要求，提示比浊法能够准确测定硫酸多黏菌素E效价。

    3  结论

    (1)比浊法能够快速、准确地测定硫酸多黏菌素E效价，检测时间由杯碟法的20h缩短到4h，方法重现性好，相对误差小于5%。

    (2)比浊法进行硫酸多黏菌素E效价测定时应注意培养基的质量以及检测仪器等。培养基配置后应过滤后再灭菌，以免培养基中形成沉淀影响测量。试管应选同一批、同一型号，管壁均匀一致，试管洁净无污染，以免影响测量结果。培养结束后立即冷却，测定前应摇匀。

 

 作者：佟斌 吴兆亮 殷昊 赵艳丽 《中国抗生素杂志》

【参考文献】

  ［1］ Starkey D D, Antoinette I, Ralph J W. Paradoxical synergism and antagonism between serum and antibacterial activity of colistin ［J］. J Infect Dis,1971,23(4):392

［2］ Jian L, Roger L N, Robert W M, et al. evalsuation of colistin as an agent against multiresistant Gramnegative bacteria ［J］. Int J Antimicrob Agents,2005,(25):11

［3］ 吴佩玲. 改进硫酸粘杆菌素含量测定方法的介绍［J］. 中国兽药杂志，1990，3：22

［4］ 张纯平，肖希龙. 硫酸粘杆菌素微生物检定法的改进［J］. 中国兽药杂志，2002，36(4)：33

［5］ 杨亚莉, 胡昌勤. 中国药典2005年版微生物检定法的增修订情况及要点［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(12)：707

［6］ The European Pharmacopoeia Commission. The European Pharmacopoeia［S］. 5ed.Brussels: Council of Europe,2002

［7］ 张治锬. 抗生素药品检验［M］. 北京：人民卫生出版社,1987：80

［8］ 朱会琴，逢涣欢，胡昌勤，等. 浊度法测定两性霉素B及其脂质体的效价［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(12)：752

［9］ 沈萍，范秀容，李广武. 微生物学实验(第三版)［M］. 北京：高等教育出版社，1999：97

［10］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2005年版(二部)［S］. 北京：化学工业出版社，2005：附录XIA