摘要：目的探讨柠檬醛体外诱导白念珠菌耐药性的反应情况，进一步评价柠檬醛的临床应用价值。方法①参照NCCLS M27A方案中的微量液基稀释法测定柠檬醛和氟康唑对原始白念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC)；②采用多步诱导法，观察在含梯度浓度(1～50MIC)柠檬醛培养基上连续转种的白念珠菌MIC的变化情况，以氟康唑作为阳性对照，同时设空白对照和溶媒对照；③将敏感性下降的诱导株在无药培养基上连续转种10次后，检测其MIC值；④测定柠檬醛对氟康唑敏感性下降诱导株的MIC值。结果①柠檬醛和氟康唑对原始白念珠菌的MIC值分别为：0.162 μg/ml和2.0 μg/ml；柠檬醛对原始白念珠菌的MFC值为0.324 μg/ml，氟康唑在实验的最高浓度(64 μg/ml)未发现有杀菌作用。 ②在多步诱导培养过程中，柠檬醛组的MIC值始终保持不变，未诱导出对柠檬醛耐药的白念珠菌菌株，菌株转种至含10 MIC柠檬醛的培养基时，即停止生长，而在含50 MIC氟康唑的培养基上菌株仍能生长。氟康唑诱导组菌株在培养过程中，MIC值逐渐升高，转种至50 MIC时，其MIC (命名为FR株)是其亲株的12倍。③FR在无药培养基上连续转种10次后得到FR＇，氟康唑在FR＇的MIC为20.16 μg/m，与FR相比，差异无显著性(P＞0.05)；④柠檬醛对FR的MIC值为0.189 μg/ml，与其相应的原始菌株无差异。结论 柠檬醛不易产生耐药性，且对氟康唑敏感性下降的诱导株仍敏感。柠檬醛是一种有良好开发前景的抗系统性念珠菌感染的天然药物。

　　关键词：白色念珠菌；  柠檬醛；  氟康唑；  耐药

　　Studies on Resistant Induction of Citral to Candida albicans in vitro

　　Abstract：ObjectiveTo investigate whether it is likely to induce Citral-resistant Candida albicans mutations in vitro, in order to give further evalsuations of its antifungal actions for clinical use. Methods①The minimum inhibitory concentration(MIC) and the minimum fungicidal concentration(MFC) of citral against C. albicans were measured by broth microdilution method according to document M27-A published by the National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS);  ② A C. albicans strain was induced by serial subcultures on agar medium containing different concentrations of Citral (equivalent to 1MIC～50MIC), and 3 groups were set as control groups which were fluconazole group  (positive control), 1.5% alcohol group(solvent control), drug-free group, respectively. The susceptibilities (MIC) of this parental strain and its respective derivatives to Citral and fluconazole were measured.  ③ The induced less susceptible derivatives were subcultured on drug-free medium for 10 times consecutively, then their MICs were tested.  ④ The MIC of induced fluconazole less susceptible derivative to Citral was also measured. Results① MIC of citral and fluconazole against C. albicans were 0.162μg/ml and 2.0 μg/ml, respectively; MFC of citral was 0.324μg/ml and fluconazole with maximum concentration in this experiment was not detected to have fungicidal action.  ② After subcultured to the medium containing 10MIC Citral, there was no visiable colony. No Citralresistant mutants could be induced (the MICs of serial subcultrues were similar to that of the parental one). While the strain could acquire some resistance to fluconazole (up to 12fold the parental MIC, designated FR) with the increase of inducing passages.  ③After FR was subcultured repeatedly on drug-free medium, we got FR' which showed no significant MIC difference with FR.  ④The MIC of FR to Citral was still the similar to that of the parental one.ConclusionCitral is a potential antifungal Chinese herb, and might be used for the treatment in Candidiasis.

　　Key words：Candida albicans;    Citral;   Fluconazole;  Drug tolerance

   

　　近年来，由于各种原因引起免疫机能受损人群的急剧扩大，真菌感染的发病率快速增长，深部真菌感染已成为这部分患者的主要死亡原因之一［1］。过去常采用两性霉素B、5氟胞嘧啶等治疗深部真菌感染，但这类药物的毒副反应较多。唑类尤其是以氟康唑为代表的三唑类药物的出现使深部真菌病的治疗有所改观，但随着这类抗真菌药物的被广泛使用，真菌耐药现象日趋严重，使临床深部真菌感染的治疗面临极大的挑战［2］。文献报道许多中药对念珠菌都有极好的抑菌和杀菌作用［3］，但中药在应用过程中能否诱导真菌对中药产生耐药性国内外较少报道。本实验以白念珠菌为研究对象，以中药山苍子主要有效成分柠檬醛为诱导剂，并设立氟康唑为阳性对照，采用连续传代培养方法，观察了白念珠菌对药物诱导的耐药反应，现报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1   实验菌株及菌液配制 白念珠菌(Candida albicans)标准菌株(ATCCC 14053)，北京大学真菌和真菌病研究所提供。将菌株移种在沙氏固体培养基上，置37℃培养24 h，经无菌NS洗涤后用血细胞计数板计数，以沙氏液体培养液或含10％小牛血清RPMIl640培养液( Sigma公司)配成所需浓度待用。

　　1.1.2   培养基RPMI1640培养液：RPMI 1640(Sigma公司)10 g，NaHCO3 2.0 g，吗啡啉丙磺酸(morpholine propanesulfonic acid，MOPS) 34.5 g(0.165 mol/L)，加三蒸水900 ml溶解，1 mol/L NaOH调pH至7.0(25℃)，定容至1 000 ml，滤过消毒，4℃保存。沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)：蛋白胨10 g，葡萄糖40g，琼脂18 g，加三蒸水900 ml溶解，加入2 mg/ml氯霉素水溶液50 ml，调整pH至7.0，定容至1 000 ml，高压灭菌后4℃保存。

　　1.1.3  药品柠檬醛(citral  C10H16O )，比重0.887～0.889，德国进口。使用前用75％乙醇溶解后，用1640液稀释成41.44 μg/ml；氟康唑(fluconazole, FCZ)由上海三维制药有限公司提供，批号20041104，用三蒸水溶解配制成1 280 μg/ml的母液作为储存液。

　　1.1.4   仪器酶标仪，真菌培养箱，紫外分光光度计，电子分析天平。

　　1.2  方法

　　1.2.1   最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MFC)测定参照美国国家临床实验室标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)推荐的M27A方案［4］，采用微量稀释法分别测定柠檬醛和FCZ对实验原始菌株的最低抑菌浓度(MIC)。将上述药物浓度大于 MIC的微孔内培养液混匀，各取100 μl，接种于不含药物的SDA培养基上，37℃孵育5 d，取无菌落生长的最小药物浓度为药物的最低杀菌浓度(MFC)。

　　1.2.2  耐药菌株的诱导将浓度为1.0×105CFU/ml的白念珠菌菌液0.1ml均匀涂至3个含1 MIC药物的SDA平皿(平皿内径90 mm) 后，置于37℃恒温孵育5 d，观察并计数菌落数，然后，每个平皿随机挑取3个菌落测定MIC，选取MIC最大者向高一浓度的培养基转种。以此类推，使菌株于含药物浓度逐渐升高的SDA培养基上连续转种(次数与培养基含药浓度的对应关系为：第1次，1 MIC；第2次，2 MIC；第3次，4 MIC；第4次，10 MIC；第5次，20 MIC；第6次，50 MIC。若菌株在某一浓度含药培养基未能生长，则该浓度为实验终浓度，菌株停止向高一浓度培养基转种。另设空白对照组和溶媒（含1.5%乙醇）对照组，其转种次数与转种次数最多的含药组一致。

　1.2.3  耐药稳定性将诱导成功后的耐药株在不含药物SDA的培养基中培养，每2天转种1次，每传2代测1次MIC值，以判断耐药的稳定性。

　　1.2.4  柠檬醛对氟康唑敏感性下降诱导株的MIC值测定方法同1.2.1。

　　1.2.5  统计学分析所有数据输入计算机后，用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理， MIC值组内、组间的比较采用 t检验和方差分析，结果以P ＜ 0. 05为具有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  原始菌株MIC值及MFC值的判定 根据M27-A方案，柠檬醛和氟康唑对白念珠菌的MIC值分别为0.162 μg/ml，2.0 μg/ml。柠檬醛对白念珠菌的MFC值为0.324 μg/ml，相当于2 MIC，氟康唑在本实验的最高浓度(64 μg/ml，相当于32MIC )，未发现有杀菌作用。

　　2.2  各组菌株的生长情况在诱导耐药过程中，空白对照组和溶媒对照组菌落数最多且稳定，与相应含药组相比有显著差异(P＜0.001)。柠檬醛组菌落数较相应氟康唑诱导组少。菌株转种至含10 MIC柠檬醛(1.62 μg/ml)的培养基上时，即停止生长，而氟康唑组在含氟康唑50 MIC (100 μg/ml )的培养基上仍有菌落生长（将从此培养基上得到的子株命名为FR，Fluconazole Resistancec），见表1。

　　2.3  MIC值的变化情况在连续转种过程中，柠檬醛诱导组、空白对照组和溶媒对照组各子株的MIC值未见明显变化，3组之间柠檬醛的MIC值差异无显著性(P＞0.05) ；氟康唑诱导组菌株的MIC值逐渐升高，转种至10 MIC (20 μg/ml)时为11.76 μg/ml，是其亲株(2.0 μg/ml)的6倍；转种至50 MIC时为23.52μg/ml (FR)，是其亲株的12倍。空白对照组菌株氟康唑的MIC值未见明显变化(P＞0.05)。氟康唑诱导组和空白对照组菌株之间氟康唑的MIC值差异有高度显著性(P＜0.001)。各组MIC值的具体变化情况见表2。

　　表1  诱导耐药过程中各组平皿生长的菌落数比较（略）

　　表2  诱导耐药前后MIC*的变化（略）

　　*表中数值为各测试时各组MIC最高菌落的MIC几何均数

　　2.4  耐药性稳定实验FR株在空白培养基上连续传代后各子株MIC值无明显改变，至第10代其MIC值为20.16 μg/ml，与FR相比，差异无显著性(P＞0.05)，说明氟康唑诱导产生的耐药性相对稳定。

　　2.5  柠檬醛对氟康唑耐药诱导株的抑菌活性柠檬醛对FR的MIC值为0.189 μg/ml，与其相应的原始菌株无明显差异，说明柠檬醛对氟康唑敏感性下降菌株仍保持很好的抑菌活性。

　　3  讨论

真菌耐药现象日趋严重，使临床深部真菌感染的治疗面临极大的挑战。真菌的耐药性可分为天然性耐药和获得性耐药，前者指暴露于药物之前就存在的耐药性，而后者则是指接触药物后才出现的耐药性。获得的耐药性既可以是可逆的也可以是稳定的遗传学改变的结果［5］。文献报道白念珠菌因自然突变而导致耐药性发生率很低，而与菌株对药物的适应性密切相关［6］。白念珠菌耐药性的产生主要存在以下3种分子机制：麦角甾醇生物合成通路中关键靶酶的变化；真菌胞膜内药物浓度的降低；生物被膜的形成等［7］。无论由于何种机制，菌株获得耐药性的稳定性限制了临床对耐药株出现后的治疗策略，因此，在开发抗真菌新药和对抗真菌药物进行评价时，除了对其治疗效果进行考察外，从长远的观点看，还应考察真菌对它们的适应性进化问题。柠檬醛是从中药山苍子提取的一种单体活性成分，我们的既往研究发现其对多种真菌都有较强的抑制作用［8，9］，为评价柠檬醛的临床应用价值，开发其作为新的抗真菌药物的可行性，本实验采用多步骤连续传代培养法观察了白念珠菌对柠檬醛的耐药反应，并以正在广泛研究的抗真菌药物氟康唑作为对照。结果发现，随着培养基中柠檬醛浓度的增加，白念珠菌菌落数逐渐减少，至10 MIC（1.62 μg/ml)时，即无菌落生长，且MIC值始终无明显变化，而氟康唑组在诱导耐药过程中，白念珠菌菌落数均高于相应柠檬醛组，至实验终浓度50 MIC (50 μg/ml )时，菌落仍生长良好，且随着培养基中氟康唑浓度的增加，处理时间的延长，菌株对氟康唑的敏感性下降(实验前MIC/实验后MIC＞10倍)。将诱导对氟康唑敏感性下降的白念珠菌接种在无氟康唑的培养基中连续转种10代，其耐药性保持稳定(MIC值变化在1个稀释度内)。该结果表明，氟康唑能诱导产生耐药，且获得的耐药性是可稳定遗传的，而柠檬醛不能诱导白念珠产生耐药性。此外，交叉耐药实验结果提示柠檬醛对氟康唑敏感性下降菌株仍保持很好的抑菌活性，推测与在较高浓度时有杀菌作用有关。机体是一个复杂的动态系统，体外实验结果不一定能反映体内真实情况。柠檬醛的体内代谢过程，具体作用位点及药物作用后真菌相关基因型的改变还有待进一步研究。

  作者：张文平，王小丽， 黄真，曹镐禄 《时珍国医国药》

　　参考文献：

　　［1］  Sanglard D, Odds FC. Resistance of Candida species to antifungal agents: molecular mechanisms and clinical consequence ［J］. s. Lancet Infect Dis. 2002, 2(2):73.

　　［2］  Jain P, Khan ZK, Bhattacharya E, et al.Variation in random amplified polymorphic DNA (RAPD) profiles specific to fluconazole-resistant and -sensitive strains of Candida albicans［J］. Diagn Microbiol Infect Dis. 2001,41(3):113.

　　［3］  方建茹,龙凯,谢小梅.中药抗真菌的研究进展［J］.上海中医药杂志, 2005,39(3):60.

　　

　　［4］  National Committee for Clinical Laboratory Standards．Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast.Tentative Standards M27-T［J］．Pennsylvania：NCCLS，1997 : 1.

　　［5］  Kontoyiannis DP, Lewis RE. Antifungal drug resistance of pathogenic fungi ［J］.Lancet. 2002, 359 (9312): 1135.

　　［6］  Cowen LE, Kohn LM, Anderson JB. Divergence in fitness and evolution of drug resistance in experimental populations of Candida albicans［J］.J Bacteriol. 2001 ,183(10):2971.

　　［7］  Sanglard D．Resistance of human fungal pathogens to antifungal drugs［J］. Curr Opin Microbiol. 2002,5(4):379.

　　［8］  谢小梅, 张文平, 傅颖媛, 等. 柠檬醛与柠檬醛抗曲霉菌作用机制的研究［J］.中草药,2004,35(4): 430.

［9］  张文平, 刘志春, 刘建新, 等. 微量法测定柠檬醛、柠檬醛体外抗深部真菌活性［J］.赣南医学院学报, 2004,24(4)：364.