铜绿假单胞菌是一种临床上常见的医院内的条件致病菌，本研究通过对耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药分析，了解耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制，以利于临床合理用药。现报道如下。

　　1.1  资料 

　　(1)菌株：收集自200５年1至12月本院ＶＩＴＥＫ－３２仪检出的耐亚胺培南铜绿假单胞菌２２株。铜绿假单胞菌标准菌株ATCC 27853一株；(2)药敏纸片：头孢塞肟、头孢曲松、头孢他定、亚胺培南；(3)OprD2基因扩增试剂盒：裂解液A、裂解液B、反应液、耐热酶、阳性模板；(4)其他：9.8%（EDTA·K2+NA2HPO4），无菌生理盐水，M-H平板，血平板等。

　　1.2  方法 

　　(1)纸片扩散法初筛：将新分离的纯菌种配成0.5McFarland密涂于M-H琼脂平板（Φ70mm）10min后于平板中央贴上EDTA纸片，纸片分2组：1组为头孢塞肟、头孢曲松，在距离EDTA纸片1cm处对称分别贴上头孢塞肟和头孢曲松。另1组为头孢他定、亚胺培南，在距离EDTA纸片1cm处分别贴上头孢他定、亚胺培南。35℃培养24h后观察结果。结果判断：①出现协同现象可能为产金属酶；②不出现协同现象可能为膜通透障碍或既产金属酶又有膜通透障碍；(2)粗提酶（冻融裂解法）将新分离的纯菌种配成0.5McFarland,取50μl于肉汤中35℃培养增菌24h后取1ml于离心管（1.5ml）中，-80℃反复冻融数次，培养无菌生长后于4℃离心机，以10000转/min离心25min，取上清液后-80℃保存待用；(3)改良三维试验［１］： 将铜绿假单胞菌标准株ATCC27853配成0.5McFarland密涂于M-H平板（Φ90mm）待干后于平板中央贴上亚胺培南纸片，距纸片2mm处分别成180°打2个宽1mm、长2cm的槽（标明①②），在①加酶粗提液20μl、②加酶粗提液+EDTA（9：1）35℃培养24h后判断结果    

　　结果判断：①有扩大生长、②抑菌圈光滑完整则为产金属酶；②有扩大生长、①抑菌圈光滑完整则为产金属酶以外的碳青酶烯酶；①、②抑菌圈均光滑完整则为膜通透性障碍；(4)PCR：菌株处理：挑取少许新分离的纯菌种置入内含无菌生理盐水（100μl）的离心管（0.5ml），离心15000rmp5min，弃上清液，加裂解液A 50μl，裂解液B 2μl，混匀后置入55℃保温1h后置入95℃保温5min ，离心10000rpm30 min，上清液即为扩增的模板液。反应体系配制：将反应液管内液体全部移入耐热酶管，以15μl至20小管，实验时将5μl膜板液移入反应体系中并加盖石蜡油2滴即可。热循环参数：95℃预变性2min然后93℃30min→55℃30min→72℃60min共循环35周期，最后一个周期72℃延长至2min。结果观察：取扩增产物10μl与2μl溴酚兰指示剂混匀，点样于2%琼脂糖凝胶中，以100v电压电泳20～30min，出现与阳性膜板分子量相同的条带（193bp）即为阳性。

　　2.1  表型初筛结果 

　　２２株铜绿假单胞菌中有１０株产生协同现象占4５．4%。  

　　2.2  改良三维试验结果 

　　２２株铜绿假单胞菌中有５株产金属酶占22.７%。

　　2.3PCR结果  　　

　　２２株铜绿假单胞菌中有４株为OprD缺失，即由膜通透障碍引起占1８.８%。 

　　2.4  22株铜绿假单胞菌抗菌药物敏感性统计见表1。表1  22株铜绿假单胞菌的抗菌药物敏感性统计 （略）

亚胺培南是一种新型的β-内酰胺类抗生素，属碳青酶烯类，具有较好的抗菌活性，且对β-内酰胺酶稳定［２］，是治疗假单胞菌感染活性最强的药物之一，但随着临床的广泛使用，耐亚胺培南菌株开始出现并日益增多，严重限制了亚胺培南的应用。铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药常不是由单一因素造成的，目前认为造成本菌耐亚胺培南的已知主要原因有4种，即(1)产生β内酰胺酶：据Pai 等报道部分菌株可能产β-类酰胺酶［３］，本实验中由于产金属酶而耐药的菌株为5株(22.7%)；(2)膜通透性障碍：即其外层细胞壁的外膜蛋白D2是碳青霉烯类抗生素进入的通道，失去特异性外膜蛋白D2导致药物不能进入细菌体内，Statake等［４］认为患者接受过其他内酰胺类药物抗感染治疗后，会诱导铜绿假单胞菌失去其膜蛋白通道oprD2，从而对亚胺培南形成耐药，本实验OprD2基因扩增结果显示：22株铜绿假单胞菌中有4株菌株表现为OprD2缺失(18.8%)；(3)细胞外膜主动外排系统的表达；(4)青霉素结合蛋白的改变：本实验未涉及3、４点，在此也作详叙述。以上可见碳青霉烯类抗生素耐药机制的复杂性。因此，在治疗铜绿假单胞菌引起的疾病时，建议在临床上选择抗菌药物时以细菌培养为前提，药敏实验结果为依据，合理选择敏感的药物治疗方案［５］，防止耐药菌株的出现和传播。

 

作者：李苏娅 史煜波《浙江临床医学》

  　　1 陈东科，张志敏，张秀珍.三维法检测β-内酰胺酶的影响因素探讨方法的改进.中华检验医学杂志，2003，26（10）：600～604.

　　2 朱琴，彭少华. 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制.医学新杂志，2002，12（4）：206～207.

　　3 Pai H , Kim J . Carbapenem resistance mechanis in pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Antimicrob Ａgents Ｃhemother ,2001,45:480～484.

　　4 Statake S, Yoneyama H ， Nakae T. Role of Omp D2 and chromosomal βlactamase in carbopenem resistance in clinical isolates of pseudomones aeruoginosa. J Antimicrob Chemother ,1991,28:199～207.

5 叶晓光，王若伦. 铜绿假单胞菌耐药性动态变化特征及分析. 中华医院感染学杂志，2004，14（6）：607～609.