【摘要】  　　目的： 研究不同龋敏感者口腔变形链球菌基因型与产酸性的关系. 方法： ①随机选取50例24～32岁的高龋、中龋及无龋者，取牙面菌斑样本接种于MS培养基上，每人随机挑取2～5株临床分离株，提取细菌染色体DNA，采用AP-PCR法对不同龋敏感者口腔变形链球菌临床分离株进行基因分型. ②以pH 0.5为间隔配制pH 4.0～7.0系列的，含50 mg/L葡萄糖的MS液体培养基，对不同基因型口腔变形链球菌临床分离株进行厌氧培养48 h，用精密pH计检测培养基上清液的pH值. 结果： ①14例高龋个体中有3例为1种基因型，5例有2种基因型，6例有3种基因型；9例中龋个体中有4例为一种基因型，3例有2种基因型，2例有3种基因型；13例无龋个体中有12例为1种基因型，1例有2种基因型. ②不同基因型的变形链球菌培养基上清液的pH值进行统计学分析，发现基因型越多的细菌其产酸能力越强. 结论： ①龋敏感越高的个体其口腔变形链球菌临床分离株基因型越多；②不同基因型的变形链球菌pH值的检测，基因型越多的细菌其产酸能力越强.

【关键词】  龋敏感者 随机引物聚合酶链法 基因型 链球菌 变异

　　Association between genotype and acidogenicity of Streptococcus mutans in subjects with different caries susceptibility

　　【Abstract】AIM: To study the genotype of Streptococcus mutans isolated from different caries-susceptible subjects and to analyse the association of the genotype with acidogenicity of Streptococcus isolates. METHODS: Plaque samples were obtained from 50 children who were 24 to 32 years old and originally plated onto Mitis-Salivarius-Bacitracin agar． Chromosomal DNA was extracted from the isolates obtained from samples by DNA kit. Then genotyping of Streptococcus mutans was carried out by arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR). Streptococcus mutans were inoculated in MS media containing 5 mg/L glucose and with different pH values (4.0～7.0),and grew in anaerobic condition （80 mL/LN2,100 mL/LH2,100 mL/LCO2）at 37℃ for 48 h. The final pH values of the solutions were measured,and then compared. RESULTS： Isolates of Streptococcus mutans were obtained from 36 subjects (total 50 subjects). 101 Streptococcus mutans strains were obtained and 31 genotypes were found. More than one genotype isolates were colonized in the same individual of 14 high-caries subjects,6 possessed three genotypes,5 possessed two genotypes，and 3 had one genotype; of  9 middle-caries subjects,2 possessed three genotypes,3 possessed two genotypes，and 4 had one genotype;of 13 caries free subjects，12 had one genotype,1 possessed two genotypes. Statistical analysis of the final pH values of culture supernatants revealed that the isolates with more genotypes presented the stronger ability of acidogenicity. CONCLUSION： AP-PCR technology can obtain genetic map of Streptococcus mutans. There are more genotypes and the higher acidogenicity of Streptococcus mutans isolates in the high-caries subjects than in the middle-caries and caries-free ones.

　　【Keywords】 caries-susceptible; arbitrarily primed polymerase chain reaction;genotype; streptococcus mutans

　　0   引言

   

　　龋病是人类常见病，不仅破坏人类的咀嚼器官，还可影响全身的营养和发育. 变形链球菌(streptococcus mutans)已被公认为龋病的主要致病菌之一［1］，因此，为了有效地防治龋病，对变形链球菌的基因分型进行分析，从分子水平研究它的产酸特性是非常重要的. 近年来随着随机引物聚合酶链反应（arbitrarily primed polymerase chain reaction，AP-PCR）技术的不断完善，其已被广泛应用于口腔变链菌的基因分型研究中，本实验我们拟采用AP-PCR对不同龋敏感者口腔中分离出的变形链球菌进行基因组指纹分析，并研究变形链球菌基因型与变形链球菌产酸性之间的关系.

　　1   材料和方法

　　1.1   材料   AP-PCR采用的随机引物,参照Mattos-Graner等文献［2］,序列为：5-TGCCGAGCTG-3 (北京华大中生科技发展有限公司),2×Taq PCR Master Mix, Proteinase K，Lambda DNA/EcoRI+HindⅢ Marker(成都博瑞克生物科技有限公司),琼脂糖(美国Sigma公司),细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）(北京天跟生物有限公司)，MS培养基（美国BD公司），硫代乙醇转送液和S．mutans血清型C的标准菌株ATCC25175(四川大学口腔生物医学重点实验室微生物室提供)，BHI培养基(美国OXOID LTD 公司). YQX-Ⅱ型厌氧培养箱(上海跃进医疗器械厂),SmartSpec Plus型核酸蛋白测定仪(美国Bio-Rad公司),7300型定量PCR仪(美国ABI公司),凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司),PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂）.

　　1.2   方法

　　1.2.1   临床分离株的分离及培养   选择井冈山大学医学院学生及青年教职员工自愿者为本研究对象. 纳入本研究的合格对象共50例，最终分离得到变形链球菌的有36例,其中无龋13例，高龋14例，中龋9例，年龄24～25岁. 常规口腔检查，记录DMFT、饮食情况、生活习惯. 要求无全身系统性疾病,取样前3 mo内未服用抗生素. 不同龋敏感者为高龋者(DMFT≥6)，中龋者(6＞DMFT≥4)，无龋者(DMFT＝0). 用无菌刮匙收集无龋者咬合面窝沟内以及邻面的菌斑,有龋者刮取龋坏附近的菌斑于盛有0.5 mL转送液的EP管中. 取原液，10-1，10-2，10-3 稀释液各50 μL分别接种于MS平板上，37℃，厌氧（800 mL/LN2，100 mL/LCO2，100 mL/L% H2）培养48～72 h后，将具有深蓝色嵌顿，质硬，表面粗糙，突起，边缘不齐等典型菌落形态和菌体形态的单个菌落接种于MS平板上，进行次代纯培养，增菌后，放在含500 g/L甘油BHI液体的EP管中，用parafilm封口,-20℃储存备用.

　　1.2.2   临床分离株的微量生化反应鉴定   用接种环收集复苏的纯培养菌落，混悬于含有1000 μL PBS的EP管中制成浓菌悬液，调整菌液浓度至A550=0.52.用微量加样枪吸取待测菌浓菌悬液，分别加入96孔酶标反应板微孔中，每孔加两滴，每种菌悬液加6孔,分别加入一滴10 mL/L的甘露醇液、山梨醇液、棉子糖液、密二糖液、七叶苷基质液，以及精氨酸基质液，以变链菌标准菌株ATCC25175为阳性对照,PBS为阴性对照，盖玻板，37℃孵育24 h，再分别于前4孔加入BM指示剂，精氨酸孔加入Nessler试剂，观察并记录颜色变化；七叶苷孔直接观察颜色改变.

　　1.2.3   提取变形链球菌染色体DNA   复苏临床分离株，37℃，厌氧（800 mL/LN2，100 mL/LCO2，100 mL/LH2）培养24 h，用无菌接种环收集菌落，采用北京天跟公司提供的基因组DNA快速提取试剂盒分别提取每个分离株的DNA，取少量DNA在核酸蛋白测定仪下测定浓度和纯度，并作为AP-PCR中的DNA模板，测A260值、A280值、并计算比值，-20℃贮存.

　　1.2.4   AP-PCR反应条件的确立   反应总体积为25 μL，包括20 mMTris-HCl,每种dNTP各500 μmol/L，3 mmol/L MgCl2，0.1U Taq聚合酶，100 mmol/LKCl,0.3 μmol/L引物，DNA 2～40 ng,不足部分用ddH2O补齐,以临床分离株染色体DNA为反应模板,在PCR扩增仪中进行循环反应. 反应条件为：94℃预变性5 min，35个循环（94℃1 min，36℃2 min，72℃2 min）后，72℃延伸5 min. 扩增完成后，取10 μL反应混合物进行10 g/L琼脂糖凝胶(已加溴化乙锭)电泳35～50 min，电压100～120 V，以Lambda DNA/EcoRI+Hind Ⅲ Marker 为分子量参照标准，在凝胶分析仪上观察扩增产物带型.

　　1.2.5   AP-PCR重复性检测   用确立的AP-PCR最佳反应条件，同一临床分离株染色体DNA模板，在不同时间进行扩增，检测所建立的AP-PCR方法的重复性.

　　1.2.6   不同基因型的变形链球菌菌悬液的制备   将复苏48 h的不同基因型的变形链球菌菌种接种于BHI培养基中，800 mL/L N2，100 mL/L H2，100 mL/L CO2在37℃下厌氧培养18 h，涂片检查为纯培养后，将菌液在4℃下以3000 r／min离心15 min，收集细菌，无菌生理盐水洗菌两次，用无菌生理盐水调整为A540nm=1.0的菌悬液.

　　1.2.7   不同基因型的变形链球菌产酸能力分析   以pH 0.5为间隔配制pH 4.0～7.0系列的，含50 g/L葡萄糖的MS液体培养基. 取各基因型变形链球菌临床分离株菌悬液，按菌液与MS液体培养基1∶10（v/v）比例接种细菌，37℃厌氧培养48 h，每个样品一式三份. 将各变形链球菌临床分离株48 h培养物经3000  r/min离心15 min，取上清液，于酸度计上测定培养物终末pH值，计算细菌降低pH能力.

　统计学处理：不同龋敏感组问携带基因型的统计分析采用SPSS13.0统计软件中的χ2检验，不同基因型的变形链球菌培养基pH值影响检测结果以x±s表示,采用SPSS13.0统计软件中的方差分析计算.

　　2   结果

　　2.1   不同龋敏感个体携带基因型的情况   本研究50例个体中培养出变形链球菌有36例，共101株临床分离株，31种不同的基因型，有5株变形链球菌分离株基因型完全相同. 14例高龋个体中有3例为1种基因型，5例有2种基因型，6例有3种基因型；9例中龋个体中有4例为一种基因型，3例有2种基因型，2例有3种基因型；13例无龋个体中有12例为1种基因型，1例有2种基因型. 不同龋敏感性的组别和其所携带不同种基因型的数量之间的关系具有统计学意义（Ρ＝0.031，表1，图1），龋敏感性越高的组别其所携带的基因型的数量也越多（表1，图1）.

　　表1   不同龋敏感个体携带基因型的情况（略）

　　χ2＝10.655,Ρ<0.05.

　　1：DNA/EcoRI+HindⅢ 标记; 2～7：不同龋敏感个体变形链球菌临床分离株基因型.

　　图1   高龋、中龋、无龋个体变形链球菌临床分离株基因型（略）

　　2.2   AP-PCR重复性检测   在确立的最佳AP-PCR反应条件下，用同一临床分离株染色体DNA为扩增模板，在不同时间，以不同稀释度的变形链球菌临床分离株染色体DNA为模板，进行AP-PCR重复性的检测，产生了相同的扩增产物带型所得的电泳带型均一致（图2）.

　　2.3   不同基因型的变形链球菌培养基pH值影响的检测   将不同基因型的变形链球菌加入培养基中厌氧培养48 h后，检测培养物上清液的pH值，数据采用SPSS13.0软件统计分析，经方差分析，F＝15.26,Ρ＝0.000，说明三组之间的差别具有统计学意义，基因型越多的细菌其产酸能力越强. 进一步的两两比较显示，各两组细菌的产酸情况均有统计学差异（P<0.05，表2）.

　　1：DNA/EcoRI+HindⅢ 标记; 2～5：11号无龋个体变形链球菌临床分离株的DNA不同浓度时的基因型； 6～8：6号中龋个体变形链球菌临床分离株的DNA不同浓度时的基因型.

　　图2   AP-PCR重复性检测结果（略）

　　表2   不同基因型的变形链球菌pH值的检测结果（略）

　　F＝15.26,P<0.05,不同种基因型的细菌两两比较pH值均有统计学差异.

　　3   讨论

     

　　龋病是严重危害人类口腔健康的一种疾病，细菌是其发生最关键的因素. 牙菌斑内的产酸活动是龋损发生的直接原因［3］，致龋菌在菌斑深层缺氧环境中通过糖酵解途径代谢食物中的糖，在短时间内产生大量乳酸和其他有机酸，并在菌斑内积累，使局部pH值下降. 在致龋菌斑中，变形链球菌无疑是产酸力最强的细菌之一，与龋病的发生、发展密切相关. 牙体硬组织脱矿，最终导致龋损的形成［4］.

   

　　AP-PCR是William等［5］于1990年发展起来的一种DNA指纹技术，是利用PCR原理，用一种任意序列的寡核苷酸引物做PCR扩增，获得一定的条带模式即指纹图谱，该指纹图谱通过增加随机引物的数量可以对任何复杂的生物变异进行基因分型. Napimoga等［6］对16例受试者的299株变形链球菌临床分离株进行基因分型，在8例无龋受试者中分离出24种基因型，平均每个受试者1～4种基因型，而在8例高龋患者中分离出44种基因型，平均每个受试者2～8种基因型，表明在不同龋敏感者中，分离出的变形链球菌基因型具有多态性. Napimoga等［6］推测高龋患者高发龋的原因可能是由于其携带有某些特定类型的基因型菌株或频繁进食酸性碳水化合物的结果，也可能是其定植的多种致龋基因型种类的变链菌菌株共同增加患龋风险的结果.

   

本研究显示提取的变形链球菌染色体DNA模板的质量合格，可产生可靠、稳定的基因组指纹图谱，且具有良好的重复性. 但是,变链菌除了进行单个基因相关性的研究外，还要综合分析多基因的研究结果，才有可能揭示遗传因子在龋病发生中的作用. 对变链菌的基因多态性进行深入研究，充分运用AP-PCR指纹技术的分型敏感性，对各基因型的变链菌与其它致龋作用进行对应研究，将对龋病的治疗产生积极的影响.

 

作者：李伟，贺新兰，胡红梅，张铮辉，王蔚，周鹏，汤洪，刘兴容  《第四军医大学学报》

  　　［1］ Korithoski B,Kraste lK,Cvitkovitch DG,et al. Transport and metabolism of citrate by Streptococcus mutans［J］. Bacteriology,2005,187(13):4451-4456.

　　［2］ Mattos-Graner RO,Li YH. Genotypic diversity of mutans treptococci in Brazilian nursery children suggests horizontal transmission［J］. Clin Microbiol,2001,39(6): 2313-2316.

　　［3］ Hamada S,Slade HD. Biology,immunology,and cariogenicity of Streptococcus mutans［J］. Microbiology,1980，44:331-384.

　　［4］de Soet JJ,Nyvad B,Kilian M. Strain-related acid production by oral streptococci［J］. Caries Res,2000,34(6): 486-490．

　　［5］ William JG,Kubelik AR,Livak KJ,et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］. Nucleic Acids Res，1990,18(22):6531-6535.

　　［6］ Napimoga MH,Kamiya RU,Rosa RT,et al. Genotypic diversity and virulence traits of Streptococcus mutans in caries-free and caries-active individuals［J］. Med Microbiol,2004,53(Pt 7):697-703.

［7］黄晓晶,刘天佳,陈国弟,等. 变形链球菌（血清型C）临床分离株AP-PCR基因分型［J］. 中华口腔医学杂志,2001,36(4):281-284.