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毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌定量研究



录入时间:2011-1-12 9:09:07 来源:中国论文下载中心

【摘要】  目的:定量研究毛细管区带电泳法(CZE)分离大肠埃希菌(E.coli)以满足临床诊断要求。方法:用毛细管区带电泳法对E.coli ATCC25922进行分离,研究其峰高与E.coli量的关系。结果:毛细管区带电泳法分离E.coli ATCC25922浓度在105cfu/ml~5×107cfu/ml之间线性很好,其峰高与浓度关系符合线性方程:㏑mAU=﹣5.256+1.0036×㏑C, R2=1。结论:CZE法分离大肠埃希菌可进行定量研究。
【关键词】  毛细管区带电泳;分离;大肠埃希菌
    [Abstract]   Objective:A quantitative study about determination of Escherichia coli (E.coli)by capillary zone electrophoresis(CZE) was to meet the clinic diagnosis request. Methods:We determined E.coli ATCC25922 by CZE and studied the linear relationship between the peak height (mAU) and the Escherichia coli concentration (C). Results:The linear relationship of  E.coli ATCC25922 concentration determined by CZE between 105cfu/ml and 5×107cfu/ml was quite good. Regression line equation is ㏑mAU=﹣5.256+1.0036×㏑C, R2=1.Conclusion: Escherichia coli ATCC25922   determined by capillary zone electrophoresis could be used for a quantitative study.
    [Key words]   Capillary zone electrophoresis; Separation; Escherichia coli大肠埃希菌是临床常见感染菌之一,由其引起的泌尿系统感染占53.6%[1],其诊断主要靠细菌培养法定量分析,但该法耗时较长(通常需2~4天)。毛细管区带电泳是20世纪80年代发展起来的一种高效分离技术,具有快速、灵敏、低耗等优点,可用于研究多种细菌的分离[2]。毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌ATCC25922定量研究,将有利于快速诊断,满足临床要求。
    1   材料和方法
    1.1   仪器   Beckman-Coulet P/ACE MDQ 毛细管电泳仪和 UV检测器, 河北永年锐沣色谱器件公司未涂层石英硅毛细管(内径75μm),上海天达pHS-3TC pH计(0.01级)。
    1.2   试剂和菌株来源   聚氧化乙烯(PEO)、Tris和EDTA(Sigma-Aldrich公司),硼酸、氢氧化钠、盐酸(上海化剂厂分析纯级),实验用水为双蒸馏水。采用上述材料配制TBE贮存缓冲液(4.5mmol/L TRIS-4.5mmol/L硼酸-0.1mmol/L EDTA,pH8.6),将其1∶16稀释,添加终浓度为0.0125%的PEO(Mn 600000),并用0.1mmol/L NaOH和盐酸调整pH至9.0,作为电泳缓冲液待用。E.coli ATCC 25922(卫生部临床检验中心)。
    1.3   方法
    1.3.1   电泳方法   采用内径75μm、有效长度(进样端至检测窗口)为40cm的石英毛细管,阳极0.5psi压力进样20s,电压25kV,电泳时间15min,25℃恒温,阴极检测,波长214nm。开机后及每一份标本检测前依次用1.0mol/L氢氧化钠、 双蒸馏水、电泳缓冲液20psi冲洗毛细管5min。
    1.3.2   检测方法   将血琼脂平板上经35℃,18~24h培养的E.coli ATCC 25922的菌落挑于电泳缓冲液中,配成5×107、107、106、5×105和105cfu/ml,静置30min后进行毛细管区带电泳。
    1.4   统计学方法   使用SPSS 11.5 for windows 软件对数据进行统计学分析。
2   结      果
    2.1   CZE分离E.coli定量电泳图   在相同条件下,应用毛细管区带电泳法分离浓度为5×107、107、106、5×105和105cfu/ml的大肠埃希菌,谱峰高度分别为316、61、6.2、2.84和0.62 mAU(毫吸光度),峰形尖锐,分离效率高。电泳图谱见图1。        
    2.2   CZE分离E.coli峰高与浓度的线性关系   根据5次定量试验结果,对大肠埃希菌浓度(C)和相应检测的峰高(mAU)分别取对数,以㏑C为横坐标,㏑mAU为纵坐标,作回归曲线,线性方程为:㏑mAU=-5.256+1.0036×㏑C,R2=1。
    3   讨      论
    细菌为胶体颗粒,比表面积极大,且覆盖着多糖类、肽聚糖、脂类等物质,这些化合物在电泳缓冲液中可因解离和吸附形成双电层;因而,毛细管区带电泳将细菌当作“离子”看待,以高压直流电场为驱动力,以毛细管为分离通道,在电渗流作用下达到高效聚焦和分离[3,4]。毛细管区带电泳法已成功分离了多种细菌,并取得非常高的分离峰效应(高达10-9表观理论塔板/m)[5]。我们发现大肠埃希菌ATCC25922通常保持较高的存活率,极易聚集出现杂峰,影响分离度。消除聚集可在电泳前使大肠埃希菌与运行缓冲液充分混匀后静置30min以利于缓冲液和添加剂充分与大肠埃希菌作用,形成相对稳定的单个离子减小聚集。
    本研究显示毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌浓度在105~5×107cfu/ml时定量实验敏感性好、分离效率高,峰高与大肠埃希菌浓度的线性关系较好,可依据峰高用回归方程分析大肠埃希菌浓度, 回归方程:㏑mAU=-5.256+1.0036×㏑C,R2=1;对于菌量<105cfu/ml,本试验可将菌液进行10倍浓缩,提高浓度后检测。
随着毛细管区带电泳技术自动化操作的实现,利用其快速、高效、重复性好等优点,为临床快速、批量分离和分析微生物提供了一个很好的选择性手段[6]。尽管毛细管区带电泳法分析微生物还存在着一些亟待解决的问题[7],但本研究显示经过实验条件的优化,其在微生物的分离和分析中可以得到很好的结果;毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌,操作简便、快速、灵敏度高、溶剂消耗少、环境污染小,具有较高的研究价值和前景。
 
   作者:王朔 王惠民,褚少朋,汪桂华 《南通大学学报(医学版)》
【参考文献】
  [1] 喻 华,刘 华,颜英俊,等.尿路感染病原菌分布及耐药性检测[J].中华医院感染学杂志,2003,13(10):983.
[2] 邓延倬,何金兰. 高效毛细管电泳[M].第1版.北京:科学出版社,2000:5.
[3] Jinjian Zheng,Edwardm S Yeung. Mechanism of microbial aggregation during capillary electrophoresis[J]. Anal Chem, 2003,75: 818-824.
[4] Meera J Desai,Daniel W. Armstrong. Separation, identification, and characterization of microorganisms by capillary electrophoresis[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,2003, 67(2):38-51.
[5] Armstrong, DW, Schneiderheinze JM. Rapid identification of the bacterial pathogens responsible for urinary tract infections using direct injection CE[J]. Anal Chem, 2000,72(2):4474-4476.
[6] 林炳承.毛细管电泳导论[M].第1版. 北京:科学出版社,1996:76.
[7] Armstrong, DW, Girod M, He L, et al. Mechanistic aspects in the generation of apparent ultra-high efficiencies for colloidal (microbial) electrokinetic separations[J]. Anal Chem, 2002,74(3):5523-5530.

 

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