病原菌与宿主的相互作用，是构成感染的基本因素。现代分子生物学的发展推动病原菌与宿主相互作用研究进入到了分子水平。应用基因芯片转录组学分析技术，可以对病原菌入侵宿主以及宿主的防御抵抗进行转录组学研究。从病原菌全基因组水平以及感染宿主的基因水平阐述病原菌与宿主之间的相互关系。阐明病原菌入侵以及宿主抵抗病原菌的分子机制，本文将对病原菌在感染宿主过程中的转录组学研究进展进行简要综述。
1 病原菌与宿主的相互作用
细菌性感染的发生和发展是病原菌与宿主相互作用的结果。感染的本质是病原性细菌为达到在宿主内生存和繁殖的目的，与宿主的各种抵御因素发生相互作用。在此期间，既有病原菌为逃避宿主防御机制而进行的适应，也有宿主为清除病原菌而调动防御体系的努力。从细菌的角度讲，由原寄生地侵袭到宿主时，环境中各种营养物质的含量、种类、温度、渗透压与酸碱度等因素的改变，以及宿主对细菌的抵抗，必然对细菌的生存施加巨大压力。为了生存，细菌能够快速敏感地监测环境中各种因素的变化，迅速地调节本身的结构，调节其生理、生命行为，达到适应新的环境，在宿主体内寄生，感染宿主目的。对于宿主来说，真核生物有着极其完善的信号转导系统，可以感知病原菌的侵入，启动严密的防御系统来抵抗病原菌的入侵。有些宿主还可以分泌一些杀菌素样的物质，导致病原菌不能在其体内生存，维持自身的正常生理状态。病原菌与宿主相互作用研究一直是控制感染性疾病发生的一个关键环节。
2 细菌的基因芯片转录组学研究
随着基因测序技术的发展与成熟，使得大量微生物基因组的序列测定完成。标志着基因组学的研究由结构基因组学进入了功能基因组学时期。转录组学研究是功能基因组学研究的一个重要手段。Velculescu和Kinzler等人于1997年首先提出转录组概念［1］。转录组学是从一个细胞中的基因组全部mRNA水平研究基因表达情况。转录组学研究作为一种宏观的整体论方法改变了以往选定单个基因或少数几个基因零打碎敲式的研究模式［2］，将基因组学研究带入了一个全新的高速发展时代。
基因芯片转录组学研究是应用全基因组芯片对不同条件下细菌的mRNA进行平行分析，可以获得细菌在不同条件下所发生的差异变化基因，从基因水平上揭示基因表达的差异。该技术的反应原理是通过对不同来源的mRNA进行逆转录，而后分别用不同颜色的荧光素标记成探针,探针混合后与芯片上的基因进行杂交,再通过扫描仪扫描，获得两份样品中RNA的相对丰度，结合已有生物信息学资源对数据进行生物学解读。
基因芯片技术的发展，为研究病原菌与宿主相互作用提供了全新的研究机会。通过基因芯片转录谱分析细菌感染宿主表达谱的差异，可以在全基因组范围获得细菌为适应在宿主体内生长而表现的基因表达差异，通过对差异表达基因的生物信息学分析可以筛选到病原体在体内存活必需表达的基因，预测与致病性密切相关的毒力基因。从而有助于进一步阐明致病菌的致病机制。芯片转录谱技术为大规模发现及鉴定病原菌致病基因提供了一个快速、有效的平台。
3 病原菌与宿主相互作用体外转录组学研究进展
应用转录谱芯片进行病原菌与宿主相互作用研究经历了体外与体内两个阶段。首先是应用病原菌与感染宿主细胞在体外进行相互作用，通过体外细胞来模拟病原菌感染宿主的微环境，获得病原菌与宿主细胞之间的相互作用规律，从而间接反应病原菌入侵宿主的转录特征与分子作用机理。
目前对多种病原菌与多种体外细胞包括上皮细胞、内皮细胞接触以及侵染多形核白细胞（PMNs）单核／巨噬细胞过程中基因表达变化进行了体外转录组学研究。通过以上研究，发现了大量微生物的毒力相关基因，存活必须基因，以及在感染过程中细菌重要的酶类和转运蛋白相关基因等。阐述了病原菌在入侵宿主过程中的相关分子机理，为进一步控制感染的发生奠定了理论基础。
世界人口的一半以上感染有幽门螺杆菌。其中只有20%的感染者会表现出临床症状。其原因可能在于感染不同类型的幽门螺杆菌以及感染宿主的不同反应。在对幽门螺杆菌致病机理的研究中，芯片转录谱技术被广泛应用。这些研究当中包括大量的幽门螺杆菌与胃上皮细胞共同作用后的转录谱研究［3～6］。例如Kim等通过对幽门螺杆菌与胃癌细胞AGS相互作用的研究结果表明［7］，在幽门螺杆菌与AGS细胞相互作用后，幽门螺杆菌毒力岛相关基因，动力相关基因，外膜蛋白相关基因发生了转录水平的上调。而在转录下调的基因当中包括压力反应蛋白基因与过氧化物分解相关基因。研究结果表明上述基因在幽门螺杆菌粘附胃上皮细胞中发挥了重要作用，与其致病能力紧密相关。
2007年10月薛建江等：病原菌感染宿主的转录组学研究进展第5期2007年10月河北北方学院学报（医学版）第5期细菌性脑膜炎是儿童最常见的死亡病因，脑膜炎奈瑟氏菌为脑膜炎的病原菌。Dietrich等对该细菌在侵入机体中所遇到的两个主要阶段进行了转录谱的研究［8］以获得该病原菌在侵入机体以及适应机体的改变。通过对脑膜炎奈瑟氏菌与上皮细胞（Hela细胞）与内皮细胞（HBMEC人脑血管内皮细胞）相互作用而获得该细菌和两种细胞相互作用的转录谱，获得了该细菌在感染不同阶段所进行的转录水平的不同变化，揭示了脑膜炎奈瑟菌在感染不同阶段的分子致病机理。Schubert等人也对该菌进行了类似的转录谱研究［9］，表明在脑膜炎奈瑟菌与HBMEC相互作用中，该菌的荚膜起到了极为重要的作用。更进一步揭示了脑膜炎奈瑟菌与宿主细胞在分子水平的相互作用。
4 病原菌与宿主相互作用体内转录组学研究进展
在病原菌与感染宿主体内转录谱研究中，困扰所有微生物学工作者的一个重要问题就是存在一些技术上的难题，这些技术上的难题限制了体内进行病原与宿主相互作用的转录谱研究。这些技术上的难题主要包括原核生物mRNA的稳定性问题，宿主细胞RNA的干扰，以及宿主细胞与感染细胞的难以分离。基因芯片研究需要大量的mRNA靶分子，大多数研究所用的mRNA是从大量细胞中提取出来的，然而，感染宿主组织中很难提供如此大量的感染细菌mRNA来进行转录谱的研究。
对于上述问题的存在，可以通过提高芯片检测的灵敏度，开发可重复有效扩增RNA靶分子的技术而使问题得到解决。目前有两种方法在扩增RNA靶分子方面显示出一定优势。其一是利用PCR技术建立单细胞cDNA文库，这种方法能够有效且可重复的扩增mRNA分子，但是往往不能保证所得到的DNA文库中的拷贝数与其在细胞中的拷贝数一致。其应用需通过应用统计方法对数据进行归一化处理［10］。另一种方法是应用DNA合成和模板指导下的体外转录反应来完成的RNA体外线性扩增［11］。通过体外扩增RNA可以将微量的mRNA在体外进行放大，从而可以满足芯片检测需要。与构建文库的方法相比，这种扩增方法更具线性，更能反应真实情况。该研究方法的出现，可以为解决在研究病原与宿主相互作用的转录谱研究中RNA量的问题。相信随着该项技术的逐步完善，体内转录谱的研究将会更为广泛的开展。
Lathem等人应用RNA线性扩增技术对造成小鼠实验性肺鼠疫中感染48h的鼠疫菌进行了扩增［12］。该研究使用裂解液成功的将鼠疫细菌与肺组织细胞进行了分离，对分离到的RNA进行了扩增，进行了鼠疫菌造成肺鼠疫转录谱研究。研究结果表明，与鼠疫菌致病相关的主要毒力因子在体内感染多数表现为高表达。例如T3SS中的基因，铁摄入以及铁贮存的相关基因，通过芯片转录谱研究对鼠疫菌引起宿主感染的分子致病机理进行了阐述。
霍乱是以严重腹泻为主要症状的感染性疾病，其病原菌为霍乱弧菌。已经完成该菌的全基因组序列表明，其全基因组包含大小两个片段。大片段编码了霍乱弧菌大部分的基因，而小片段的基因功能则很少了解。Xu等应用芯片转录谱技术对分布于不同片段的基因进行了感染家兔体内转录谱的研究［13］，一方面，通过研究了解该细菌在感染宿主体内的基因转录情况，另一方面的目的是揭示小片段的基因组在感染过程中的功能。研究者通过创造性的将家兔小肠进行结扎，从而形成小肠结扎环模型，将霍乱弧菌注入结扎环内，感染一定时间后将细菌从结扎环内进行收集，收集RNA后与体外营养环境中培养的细菌进行比较，从而获得了霍乱弧菌体内感染的转录谱。研究结果表明，在发生转录明显改变的基因中大部分为大片段染色体基因。揭示了在感染家兔小肠体内该细菌的一些高转录基因包括与动力化学趋向性相关的一些基因，以及与肠内定值相关的一些基因以及与毒素产生相关的基因。对霍乱弧菌的分子致病机理进行了阐述。
空肠弯曲菌是引起腹泻的主要病原菌。该菌在小肠内成功的粘附与定植是构成其致病力的关键因素。Stintzi等人同样应用小肠结扎环的方法对空肠弯曲菌进行了感染新西兰白兔小肠的研究［14］。通过对该菌在小肠内生存所进行的转录谱研究，获得了大量与其在肠内生存相关的基因，对其致病机理进行了分子水平的研究。
Snyder等人应用芯片转录谱技术对引起泌尿感染的致病性大肠埃希氏菌进行了体内转录谱的研究［15］。该研究将从感染小鼠的尿液中直接提取细菌RNA，得到了该细菌在感染宿主体内的多个毒力与代谢因子。在与泌尿系感染相关的基因当中，有这样一些基因高表达。菌毛基因相关的荚膜形成，微生物素分泌，铁摄入相关基因转录水平明显上调，表明这些基因与大肠杆菌的致病性密切相关。
在对感染细菌与宿主相互作用研究中，不同的研究者应用了不同的方法进行了研究。例如通过对无菌部位的液体标本直接进行分离来获得研究所需要的细菌量，Orihuela对感染小鼠血液中细菌采用离心的方法进行分离［16］，通过差速离心的方法将感染小鼠血液中的肺炎球菌与血细胞进行了分离，进行了肺炎球菌感染小鼠体内的转录谱研究，获得了该细菌感染体内的特征性转录谱，对其致病机理进行了研究。Talaat等则应用全基因组引物GDP对感染组织内未进行细菌与细胞分离的结核分枝杆菌直接进行逆转录［17］，获得了感染体内结核分枝杆菌的转录谱，对结核分枝杆菌的分子致病机理进行了研究。Merrell等应用直接分离的方法对霍乱病人的米泔样粪便中的霍乱弧菌进行了分离并进行了转录谱研究［18］。Graham等应用全基因组芯片对引起化脓性感染的A族链球菌M1株进行了感染小鼠上皮组织的转录谱研究［19］，解释了在形成化脓性感染过程中参与的主要基因功能类群，包括毒力基因、氧化压力基因、氨基酸利用、二元调控系统等基因在皮肤软组织感染中的作用。对A族链球菌引起的化脓性感染的分子机理进行了阐述。Roos等人则通过收集患者尿液中大肠埃希菌83792株直接与体外培养的相同细菌进行了转录谱研究［20］。指出在该菌株致病过程中NO代谢相关基因具有非常重要的意义。同样是对尿液中的大肠埃希菌83792株，Hancock等人则进行了该菌在体内与生物膜形成的相关分子机制研究［21］，揭示了该菌在形成致病中生物膜所起的作用以及与生物膜形成的相关基因。更进一步的阐述了大肠埃希菌83792株导致泌尿系感染的分子致病机理。
5 结论
基因芯片转录谱技术在研究细菌与宿主相互作用中展示了其应用优势,极大地推动了相关研究的发展。结合原核生物基因组序列资料，通过芯片转录谱研究可以在基因水平描绘细菌如何适应宿主环境，以及为适应宿主环境所作出的基因改变。揭示细菌与环境相互作用的代谢途径、细菌的致病毒力因子以及病原菌的分子致病机制。从而为进一步控制细菌性感染的发生奠定理论基础。
作者：薛建江 邱景富 《河北北方学院学报》
【参考文献】
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