【摘要】  目的 了解临床分离的铜绿假单胞菌中β内酰胺类药物耐药相关基因研究存在状况。方法 自临床分离40株对铜绿假单胞菌，采用聚合酶链反应(PCR)检测耐药基因型(TEM、SHV、CTXM1群、CTXM9群、OXA2群、OXA10群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、SPM、GIM、DHA、MOX、FOX和oprD2)。结果 40株中CARB阳性18株(45.0%)、35株oprD2基因缺失(87.5%)，其余基因均阴性。结论 临床分离的铜绿假单胞菌CARB基因携带率高。 

【关键词】  铜绿假单胞菌； β内酰胺酶类； 耐药基因

  全国细菌耐药性监测网所属57家三级甲等医院调查发现，2002年1月～12月，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)临床分离率为10.3%，仅次于大肠埃希菌(14.2%)列第二位［1］。近年来Pa菌耐药率不断增加，已经出现对第三代头孢菌素和亚胺培南耐受的Pa菌，给临床治疗带来极大困难。研究发现，Pa菌产生各种β内酰胺酶(如TEM、SHV、OXA、PER、VEB、GES、CARB)、金属β内酰胺酶(如IMP、VIM、SPM、GIM)和质粒AmpC酶(如DHA、FOX、MOX)以及由于外膜孔蛋白D2(oprD2)缺失是对β内酰胺类药物耐药的主要机制［2～7］，但国内尚缺乏Pa菌β内酰胺类药物耐药相关基因全景式报道。为了解我院临床分离的Pa菌对β内酰胺类药物耐药机制，本文继对40株Pa氨基糖苷类修饰酶编码基因研究［8］之后，检测18种β内酰胺类药物耐药相关基因型(TEM、SHV、CTXM1群、CTXM9群、OXA2群、OXA10群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、SPM、GIM、DHA、MOX、FOX和oprD2)，报告如下。

    1  材料与方法

    40株Pa菌的来源、药敏试验及细菌处理均与文献［8］相同。

    基因检测采用PCR法，各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各0.5μmol/L，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，TrisHCl(pH9.0) 10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%(wt/vol)，Taq DNA pol 1U。总反应体积20μl(其中模板液5μl)。热循环参数(PCR产物长度>500bp)PCR为：93℃预变性2min，然后93℃ 60s→55℃ 60s→72℃ 60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min，其余均为：93℃预变性2min，然后93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

    2  结果

    2.1  药物敏感性试验

    参见文献［8］。

    2.2  基因PCR检测

    40株Pa菌中CARB阳性18株(45.0%)、oprD2基因缺失35株(87.5%)，其余基因均为阴性。图1为balCARB基因PCR产物电泳图，balCARB基因扩增产物经测序和BLAST程序分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)为CARB3型(与CARB3型基因序列［注册号DQ359232］高度同源，一致率100%)，Pa03号株balCARB基因序列与GenBank中balCARB序列同源性聚类分析(软件DNAMAN)见图2；图3为oprD2基因PCR产物电泳图。转贴于中国论文3  讨论

1992年法国巴黎发现的TEM42是在Pa菌中第一个被报道的A类ESBLs［9］，最近国内报道在Pa菌中检出TEM、OXA、IMP、VIM、GES和DHA β内酰胺酶等基因［10～15］。本组40株Pa菌中仅检测到CARB型基因和oprD2基因缺失。CARB型基因编码产生羧苄西林酶，为β内酰胺酶Bush分类中的2c，CARB型基因最早于1981年在Pa菌中发现［16］，近年又从不动   表2   与国内其它医院Pa菌β内酰胺类药物耐药相关基因型检测结果比较［菌株阳性数 杆菌、弧菌属、奇异变形菌中检出，已发现CARB19型9个亚型。羧苄西林是第一个用于抗假单胞菌感染的半合成青霉素类药物，哌拉西林(第三代半合成青霉素类药物)抗菌谱广，抗假单胞菌活性比羧苄西林强数十倍，常用于治疗Pa菌感染，但哌拉西林对β内酰胺酶不稳定［16］。羧苄西林、哌拉西林的抗菌活性受CARB型基因编码产生的羧苄西林酶影响［17］。国内钱小毛等［18］报道在Pa菌中检出CARB型基因，阳性率为30.8%，但未对CARB型基因的亚型进一步分型。我们研究中40株Pa菌中CARB型阳性18株(45.0%)。Pa03号株CARB型基因PCR扩增产物经测序和BLAST程序分析为CARB3型(与CARB3型基因序列［注册号：DQ359232］高度同源，一致率100%)。我国CARB型基因流行亚型以及携带CARB型基因Pa菌对常用CARB型基因的耐药特征未见报道。β内酰胺类抗生素对Pa的作用靶位是细菌内膜上的PBP2，该类药物要到达其作用靶位必须首先经过外膜通道进入周浆间隙。如果菌株外膜蛋白通道减少或缺失，药物难以到达其作用靶位，细菌将产生耐药。本组40株Pa菌中oprD2基因缺失阳性35株(87.5%)，表明产羧苄西林酶和oprD2基因缺失是我院流行株，与近期报道的其它医院相比，不同医院检出状况不同。

 

  作者：王伟 陈瑛 钱芳 毛剑峰 薛武进《中国抗生素杂志》

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