【摘要】  目的 研究志贺菌外排泵基因emrE的耐药功能及其进化。方法以志贺菌临床多重耐药株H24基因组为模板，扩增出含emrE基因的1126bp DNA片段，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化大肠埃希菌DH5α，对阳性克隆酶切鉴定和测序；用琼脂平皿二倍稀释法对重组菌株进行药敏测定并测定泵抑制剂CCCP对MIC值的影响；通过RT-PCR从mRNA水平检测emrE的表达水平；通过Genbank数据库对基因序列进行同源性比对，建立进化树并分析同源基因之间的关系。结果含emrE基因质粒可以提高大肠埃希菌对四环素耐药性1倍，对红霉素的耐药性1倍；对emrE基因的同源分析显示H24菌株和大肠埃希菌、其它志贺菌可归为相近一族，同源性在92%以上，与同属于肠杆菌科的欧文杆菌和沙门菌的同源性分别为70%和60%；与亲缘关系较远革兰阳性菌除虫链霉菌和结核分枝杆菌的同源性仅为47%和48%。结论 志贺菌耐药株H24的emrE基因与对四环素及红霉素的耐药性相关，依据现有数据进行的emrE基因同源分析未发现有明显的基因水平转移现象。

【关键词】  志贺菌； emrE基因； 外排泵；耐药； 基因水平转移

    ABSTRACT  Objective  To study the function and phylogenetics of the active efflux pump gene emrE in clinical isolates of Shigella.  Methods  The active efflux pump gene emrE was amplified by PCR and ligated with the pMD18-T plasmid to construct the recombinant pMD-emrE, and the pMD-emrE was transformed into E.coli DH5α. The positive bacterial clones were identified by restriction enzyme digestion, and the gene of isolates was sequenced and analyzed. Drug susceptibility of the recombinant strain was tested by the two fold agar dilution method; phylogenic tree was constructed with the data of the gene sequences from Genbank.  Results Plasmid pMD-emrE can elevate the resistance level of E.coli to tetracyclin by one fold and erythromycin by one fold. Analysis of emrE phylogenic tree indicated that strain H24, all strains of E.coli and all other strains of Shigella could be classified into one group with 92% gene sequence identity. Strains of Erwinia and Salmonella, which also beloned to Enterobacteriaceae, had 70% and 60% sequence identity with H24. Streptomyces avermitilis and Mycobacterium tuberculosis were only 47% and 48% sequence identity with H24.  Conclusions  The gene emrE was related to the resistance of tetracycline and erythromycin in the drug resistance strain H24. Phylogenic tree analysis indicates it was scarce for emrE to develop horizontal gene transferring among different bacterial genomes.

    KEY WORDS  Shigella;emrE;Active efflux pump;Antibiotic resistance;Horizontal gene transfer

    志贺菌属(Shigella)细菌是急性感染性腹泻的主要病原体之一。全世界每年由志贺菌引起的感染病例数超过2亿，约占腹泻病例的15%以上［1］。我国以福氏和宋氏志贺菌引起的痢疾最为常见。临床上志贺菌对抗生素和其它化学药物的耐药性日趋严重，如对目前临床广泛使用的喹喏酮类药物的耐药率已达40%以上，严重影响了临床治疗效果［2］。鉴于志贺菌对人类的严重危害性，研究志贺菌多重耐药机制，调查这些基因的特性及分布进化，对临床病原菌多重耐药性的治疗具有重要意义。

    主动药物外排(active drug efflux)或称外排泵系统(efflux pump system)耐药机制的研究始于20世纪80年代关于大肠埃希菌对四环素耐药机制的研究［3］。目前已发现主动外排泵系统广泛存在于革兰阴性细菌和革兰阳性细菌中，它们在细菌的多重耐药中发挥着重要作用［4～6］。1998年，Ghosh等发现志贺菌中存在着主动外排机制［7］，国内杨海燕等证实了志贺菌内也存在着Acrab-Tolc泵，它在喹诺酮类药物耐药中起重要作用［8］，但目前为止尚缺少对其它志贺菌外排泵引起耐药性的深入研究。

    H24是本实验室保存的从郑州市和江西省铜鼓县采集的临床致病志贺菌中筛选出的具有很强的多重耐药菌株之一［9］，现已克隆了该菌株多个多重耐药主动外排泵基因。期望通过这些基因的耐药特性研究和用这些耐药基因建立药物筛选模型，发现有针对性的抗菌药物，如耐药主动外排泵抑制剂等。

    外排泵基因emrE属于小多重耐药性家族(SMR)。SMR耐药泵家族是已知细菌中最小的多重耐药外排泵。通常由100多个氨基酸组成，形成四个跨膜螺旋。前3个跨膜螺旋为双亲性，含有许多保守的谷氨酸、丝氨酸、酪氨酸及色氨酸残基，这些残基的侧链与底物的疏水区域直接作用而介导它们的跨膜转运。SMR转运蛋白为PMF能量来源型(第二类主动外排系统)［10］。SMR家族成员均来自于细菌，其中最典型的是大肠埃希菌的EmrE泵。通过对大肠埃希菌的EmrE泵研究发现SMR耐药泵是通过多聚体的形式发挥功能的，形成同源三聚体［11，12］或四聚体［13］。目前已在多种菌株中发现emrE外排泵基因的分布，但其序列有较大差异，其进化意义和生理意义尚不十分明了。大肠埃希菌中emrE编码的外排泵蛋白能引起对甲基紫精、四苯溴化磷、溴化乙啶、吖啶黄、结晶紫及红霉素、四环素和磺胺嘧啶等的耐药性［14，15］。本文报道克隆了包括调控序列在内的完整志贺菌emrE耐药泵基因，并在大肠埃希菌中测定了它的耐药特性，同时初步分析了该基因在细菌中的分布和进化关系，为近一步进行耐药性研究奠定了基础。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    (1)菌种及质粒  大肠埃希菌DH5α及临床分离志贺菌多重耐药株H24由郑州大学公共卫生学院流行病教研室收集保存；大肠埃希菌药敏质控株ATCC25922由河南省疾病预防控制中心惠赠；pMD18-T载体购自大连TaKaRa公司。pMD18-T载体由pUC18改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切后，再在两侧的3′端添加“T”而成。它易于与PCR产物联接并与pUC18具有相同的功能，选择标记为氨苄西林抗性基因，通常用作克隆载体，但也能适度表达。

    (2)工具酶及试剂  SacI内切酶、BamHI内切酶、胰RNA酶、DNA回收试剂盒均为TaKaRa公司产品；抗生素购自中国药品生物制品检定所；酵母提取物和蛋白胨为Oxiod公司产品。泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)为Sigma公司产品。MH培养基为北京奥博星公司产品。Trizol RNA提取试剂盒，AMV反转录酶试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

    1.2  志贺菌临床株多重耐药株的筛选

    在MH培养基上用琼脂平皿二倍稀释法测定临床收集的30株志贺菌耐药株对四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、环丙沙星、磺胺和硫酸链霉素的最低抑菌浓度(MIC)。标准质控菌为ATCC25922。

    1.3  志贺菌基因组DNA的提取

    按常规方法进行［16］。

    1.4  志贺菌临床株多重耐药株emrE基因片段的获取

    (1)基因扩增  从GenBank中查到志贺菌emrE基因序列，利用Primer 5.0设计引物。引物设计的位点包含有emrE基因的调控序列，同时使其自身的启动子与pMD-T载体的lac启动子在同一方向上但与lac启动子相隔约300bp，以期用自身的启动子表达［15］。上游引物P1为CGGGAGCTCAGCCTCAG-TTTCTATG，下游引物P2为GCGGATCCAACAG-TCCAGTGCC。引物由北京赛百盛公司合成。以志贺菌临床多重耐药株H24为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增。PCR条件为：95℃ 5min，94℃ 40s，58℃ 45s，72℃ 90s，30个循环，72℃延伸10min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为1%。

    (2)目的片段的回收  PCR产物计50μl，1%琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa公司的DNA快速回收试剂盒回收，方法参考产品说明书。

    1.5  pMD-emrE重组质粒的构建

    PCR扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳后用TaKaRa公司片段回收试剂盒回收目的片段，再与pMD18-T载体在16℃连接过夜。用连接产物转化大肠埃希菌DH5α，涂布于含60μg/ml Amp的LB琼脂平板上，37℃培养过夜后，利用蓝白斑筛选挑取少许白色单克隆，在含Amp的LB液体培养基中培养过夜。碱裂解法从菌液中提取质粒，用SacI单酶切及SacI和BamHI双酶切进行鉴定。

    1.6  pMD-emrE重组菌株耐药性测定及CCCP对其耐药性的影响

    以转入pMD18-T空质粒的DH5α菌为对照，采用琼脂平皿二倍稀释法测定上述7种抗生素对筛选出的pMD-emrE重组菌株的MIC。同时在另一组含抗生素的MH琼脂平板中加入CCCP至20μmol/L测定细菌的MIC值。

    1.7  RT-PCR检测pMD-emrE重组菌株及pMD18-T空白对照株emrE基因的表达水平

    利用Trizol RNA提取试剂盒提取pMD-emrE重组菌株的总RNA，并用AMV反转录试剂盒进行反转录，得到2株菌的cDNA，利用Primer 5.0设计引物P3(GGGTTTACACGGTTATGGC)和P4(CTATGATGGCTGGCAGGTC)，扩增emrE基因内部的190bp DNA片段；引物P5(CTGGTCCGTCTAAA-GACAACA)、P6(ACGAACGGTCAGGTCAACTA)扩增大肠埃希菌内稳定表达的看家基因-编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gapA基因的380bp片段作为内参。分别以2株菌的cDNA为模板，同一反应管中同时扩增emrE基因片段及甘油醛3-磷酸脱氢酶gapA基因片段。每个菌株测3次，每次都采用相同的反应条件。循环扩增条件：94℃ 5min，94℃ 40s，52℃ 45s，72℃ 90s，72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖电泳后进行凝胶扫描半定量分析。

    1.8  序列测定及分子进化研究

    取酶切鉴定正确的重组质粒进行纯化并由上海生物工程有限公司测序。测序结果利用DNAStar软件分析找出emrE基因的编码框，用BLASTn在Genbank中搜索同源序列，分析其结果。用在Genbank搜索出已报道的emrE的编码序列，经MEGA3进行序列比对并构建分子进化树。

2  结果

    2.1  耐药株的筛选

    利用琼脂平皿二倍稀释法筛选出的临床志贺菌多重耐药株H24对7种抗生素均呈不同程度的耐药性，结果见表1。结果显示该菌对四环素、红霉素、氯霉素和硫酸链霉素MIC值都在64μg/ml以上，呈高度耐药；对环丙沙星、庆大霉素等抗生素耐药程度则较轻。

    2.2  emrE基因的PCR扩增

    用所合成的一对引物PCR扩增福氏志贺菌H24的emrE基因，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在约1126bp处有一特异扩增条带，分子量大小与预期扩增值相符(图1)。

    2.3  pMD-emrE重组质粒的鉴定

    用SacI单酶切和SacI和BamHI双酶切对所提质粒进行鉴定，经1%琼脂糖凝胶电泳后，确认得到了含目标基因的重组质粒(图2)。

    2.4  重组大肠埃希菌菌株的耐药性检测及CCCP对其耐药性的影响

    重组大肠埃希菌菌株的MIC如表2所示，结果表明携带有重组pMD-emrE质粒的菌株与携带空质粒的菌株相比耐药性有所增强。对红霉素和四环素的MIC均为对照株的2倍，显示该基因有增强细菌耐药性的作用。加入CCCP后，2株菌对不同抗生素的MIC值均有不同程度的下降，并且下降到了同一水平，显示耐药性对跨膜质子梯度的依赖性(表2)。表1      志贺菌多重耐药株H24的MIC(μg/ml)（略表2    重组菌株pMD-emrE的MIC(μg/ml)（略 ）

    2.5  RT-PCR结果

    对pMD-emrE重组菌株及带有空质粒的对照株用RT-PCR检测emrE基因的mRNA相对表达水平。emrE扩增片段的亮度以gapA片段为100%对照。三次凝胶扫描半定量检测结果显示pMD-emrE重组菌株emrE表达量增强，相对强度为对照的5.27倍。结果经t测验，差异极显著(P<0.01，图3和表3)。

    2.6  测序结果的序列分析及分子进化树的构建

    志贺菌临床耐药株H24 emrE基因测序结果经BLASTn与Genbank中的宋氏志贺菌株S.sonnei Ss046的emrE基因碱基序列比较分析，两者完全一 表3    pMD-emrE重组菌株emrE表达量的RT-PCR（略 ）致；与福氏志贺菌2a 301株、福氏志贺菌5及福氏志贺菌2a 477株、大肠埃希菌CFT01株和536等菌株的DNA序列一致性为98%，肽链的一致性为100%；与大肠埃希菌0157∶H7和K12等菌株的DNA序列一致性为92%，肽链的一致性为98%。在这些基因序列的变化中，多为同义突变，显示emrE耐药泵基因的保守性，结果见表4。

    利用在Genbank中检索到的不同菌株的emrE基因序列构建的分子进化树如图4所示。志贺菌和大肠埃希菌聚集为一族。该族可分为三个亚群：宋氏志贺菌为第一亚群；福氏志贺菌和大肠埃希菌536等为第二亚群；大肠埃希菌K-12和0157为第三亚群。在该族菌株中未发现含有与其它种属非常相近的emrE基因序列，也未在其它种属菌株中发现与志贺菌和大肠埃希菌族非常相近的emrE基因序列。显示了该基因的种属特征性和稳定性。对于其它菌株也表现出在进化分类上距离愈远，进化树上距离也愈远的规律，有较好相关性。

    3  讨论

    本研究克隆出志贺菌临床耐药株H24包括调控序列在内的emrE基因并连接到pMD18-T质粒上，该质粒为高拷贝质粒，emrE带有自身的调控序列，可在自身的启动子调控下进行表达。通过测定重组菌株的MIC，发现携带有emrE基因的重组菌株与未携带该基因的菌株相比对四环素和红霉素的MIC值均提高了1倍，而对其它5种抗生素的MIC值则无变化。RT-PCR结果也证实了pMD-emrE重组菌emrE基因的表达水平比pMD18-T对照株有显著提高。由此可见H24菌株emrE基因在大肠埃希菌中得到了较高表4        志贺菌和大肠埃希菌与H24菌株emrE基因的DNA和肽链序列差异（略 ）

    强度的表达。这与已报道的大肠埃希菌emrE基因的功能是相似的［17］。加入质子泵抑制剂CCCP后，重组株和对照株对四环素和红霉素的耐药性降低到同一水平，确认了emrE外排泵是质子泵。另外，加入CCCP后这两株菌对7种抗生素的MIC值均有较大幅度的下降，说明在这两株菌中还存在着其它以质子梯度为能量的外排泵。志贺菌临床耐药株H24对四环素和红霉素的MIC值都为128μg/ml，而该耐药株的emrE基因在大肠埃希菌中表达量提高后仅使它们对四环素和红霉素的耐药性分别达到8和16μg/ml(大肠埃希菌受体菌对照的MIC值分别为4和8μg/ml)，说明志贺菌临床耐药株H24对四环素和红霉素的耐药性可能还有其它的耐药基因在发挥着作用。

    通过检索发现，Genbank中200多种已经测出全基因组序列的微生物中共有20多种菌株有emrE基因，在此基础上进行同源性分析并构建进化树，发现宋氏志贺菌与亲缘关系很近的福氏志贺菌及大肠埃希菌(基因组分析显示志贺菌是大肠埃希菌复合群的一类［17］)的emrE序列的同源性非常高，在92%以上；与同属于肠杆菌科的欧文杆菌和沙门菌的同源性分别为70%和60%；而与亲缘关系较远革兰阳性菌除虫链霉菌和结核分枝杆菌的同源性仅为47%和48%。可见亲缘关系较近菌株的emrE序列同源性非常高而亲缘关系较远的序列差异较大。目前尚未发现亲缘关系较远而emrE序列同源性较高的菌株，因此可以推测emrE基因所介导的耐药是细菌在长期进化中形成的，现有资料未发现emrE基因在近代发生明显的水平转移现象。

    现代基因组学研究揭示微生物之间的基因水平转移发生的频率很高［18，19］，但为什么emrE基因的种属归属性这样强？尽管临床上四环素和红霉素已应用多年，在生态环境中有很高的选择压力，但以上分析未发现emrE基因有明显水平转移。在其它耐药泵基因的研究中，也有发现有类似的保守现象［8，20］。分析原因可能有两点：第一，微生物在自然生态环境中面临着许多有害物质和其它生态压力因素，有很多方面的选择压力在起作用，抗生素仅是其中一种；第二，我们近期研究发现许多重耐药外排泵不仅能泵出有害物质，也能泵出某些重要营养物质，这可能是耐药泵快速进化(泵出能力的垂直进化和基因水平转移进化)的一个重要制约因素。不同类群菌株的emrE基因可能只适合于特定菌群的遗传背景。关于不同微生物来源的emrE基因的功能差异和生理意义还待进一步研究。

 

  作者：吴健 张少平 穆瑞瑞 丁毅 郗园林 段广才  《中国抗生素杂志》

  ［1］ Kotloff K L, Winickoff T P, Ivanoff B, et al. Global burden of Shigella infections: implications for vaccine development implementation of control strategies ［J］. Bull WHO,1999,77(8):651～666.

［2］ 裴红生，唐耀武. 北京市1990～1997年细菌性痢疾流行病学分析［J］. 疾病监测，1998，13(11)：408～412.

［3］ McMurry L, Petrucci R E Jr, Levy S B. Active efflux of tetracycline encoded by four genetically different tetracycline resistance determinants in Escherichia coli ［J］. Proc Natl Acad Sci,1980,77(7):3974～3977.

［4］ Van Bambeke F, Balzi E, Tulkens P M. Antibiotic efflux pumps ［J］. Biochem Pharmocol,2000,60(4):457～479.

［5］ Paulsen I T, Brown M H, Skurray R A. Proton-dependent multidrug efflux systems ［J］. Microbiol Rev,1996,60(4):575～608.

［6］ Li X Z, Nikaido H. Efflux-mediated drug resistance in bacteria ［J］. Drugs,2004,64(2):159～204.

［7］ Ghosh A S , Ahamed J , Chauhan K K, et al. Involvement of an efflux system in high-level fluoroquinolone resistance of Shigella dysenteriae ［J］. Biochem Biophys Res Commun,1998,242(1):54～56.

［8］ 杨海燕，段广才，郗园林. 主动外排系统acrAB在志贺菌中分布和表达［J］. 中国公共卫生，2005，21(6)：685～687.

［9］ 朱静媛，段广才，张梅喜. 73株志贺菌属细菌对11种抗生素的耐药性分析［J］. 河南预防医学杂志，2004，15(1)：5～7.

［10］ Borges-Walmsley M I, McKeegan K S, Walmsley R I A. Structure and function of efflux pumps that confer resistance to drugs ［J］. Biochem J,2003,376(Pt2):313～338.

［11］ Rotem D, Sal-man N, Schuldine S. In vitro monomer swapping in EmrE, a multidrug transporter from Escherichia coli, reveals that the oligomer is the functional unit ［J］. Biochemistry,2001,276(51):48243～48249.

［12］ Muth T R, Schuldiner S. A membrane-embedded glutamate is required ligand binding to the multidrug transporter EmrE ［J］. EMBO,2000,19(2):234～240.

［13］ Che M, Geoffrey C. Structure of the multidrug resistance efflux transporter EmrE from Escherichia coli ［J］. PANS,2004,101(9):2852～2857.

［14］ Yerushalmi H, Lebendiker M, Schuldiner S. EmrE, an Escherichia coli 12-kDa multidrug transporter, exchanges toxic cations and H+ and is soluble in organic solvents ［J］. J Biol Chem,1995,270(12):6856～6863.

［15］ Kunihiko N, Akihito Y. Analysis of a complete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli ［J］. Bacteriol,2001,183(20):5803～5812.

［16］ 姜泊，张亚历，周殿元. 分子生物学常用实验方法［M］. 北京：人民军医出版社，1996：107～111.

［17］ Pupo G M, Lan R, Reeves P R. Multiple independent origins of Shigella clones of Escherichia coli and convergent evolution of many of their characteristics ［J］. Proc Natl Acad Sci USA 2000,97(19):10567～10572.

［18］ Nelson K E, Clayton R A, Gill S R, et al. Evidence for lateral gene transfer between archaea and bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima ［J］. Nature,1999,399(6734):323～329.

［19］ Olendzenski L, Liu L, Zhaxybayeva O, Murphey R, et al. Horizontal transfer of archaeal genes into the Deinococcaceae: detection by molecular and computer-based approaches ［J］. J Mol Evol,2000,51(6):587～599.

［20］ 余泽波，姚成，肖永红，等. 伤寒沙门菌主动外排多耐药基因acrB与表达水平研究［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(8)：489～493.