【摘要】  目的 研究产金属β-内酰胺酶(MBL)的铜绿假单胞菌感染的菌株同源性和耐药谱。方法 用纸片协同法筛选出产MBL铜绿假单胞菌株；琼脂扩散法检测MBL阳性株对10种抗菌药物的药敏结果；用肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)方法确定菌株之间的同源性。结果 纸片协同法试验检测到18株MBL阳性菌株，它们对头孢噻肟、头孢曲松、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦和头孢他啶完全耐药，对10种抗菌药物呈现7种耐药模式；ERIC-PCR结果显示，18株MBL阳性株呈现4种基因型，15株为同一基因型。结论该院ICU内产MBL铜绿假单胞菌在2005年第二季度出现暴发流行。

【关键词】  铜绿假单胞菌； 聚合酶链反应； 基因间重复一致序列引物； 金属β-内酰胺酶； 耐药谱

    ABSTRACT  Objective  To study the homology and resistant pattern of metallo-β-lactomase (MBL) producing Pseudomonas aeruginosa.  Method  Disk diffusion test was used to screen MBL producing isolates from Pseudomonas aeruginosa strains, and antibiotic susceptibility were detected by KB test. The homology among different strains was tested by enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR (ERIC-PCR) method.  Results  Eighteen strains of Pseudomonas aeruginosa producing MBL were isolated from patients in ICU. Antibiotic susceptibility data showed that all 18 strains were resistant to cefotaxime，ceftriaxone, ticarcillin/clavulanic acid, cefoperazone/sulbactam and ceftazidime, and there were seven drug-resistant profiles according to the susceptibility results of 10 antimicrobial agents. Results of ERIC-PCR genotyping showed that there were four PCR patterns, and 15 strains were in the same pattern.  Conclusions  The MBL producing strains in Pseudomonas aeruginosa appeared an outbreak in ICU in 2005.

    KEY WORDS  Pseudomonas aeruginosa;  ERIC-PCR;  Resistant spectrum;  Metallo-β-lactamase

    铜绿假单胞菌感染主要见于医院感染人群，尤其是重症监护病房(ICU)中的重症患者，是目前各种感染中最广泛、最严重的问题之一。随着能够水解碳青霉烯类抗生素的金属β-内酰胺酶(MBL)的产生，对碳青霉烯类抗生素及三代头孢菌素耐药铜绿假单胞菌的分离率日渐增多，给临床抗菌治疗已带来极大的困难。2005年4月至2005年6月，广州某三甲医院ICU从不同患者深部痰中持续分离出多重耐药的铜绿假单胞菌，其耐药谱基本相似，为明确这些分离株之间是否密切相关，采用ERIC-PCR分析同源性，并调查是否携带有金属β-内酰胺酶。

    1.1  菌株来源

    2005年4月至2005年6月从广州某三甲医院ICU患者深部痰中分离的铜绿假单胞菌23株，试验前重新鉴定。质控标准参考菌株：铜绿假单胞菌ATCC27853，来自美国菌种收藏中心。

    1.2  MBL鉴定试验    采用文献［1］报道的纸片协同法确认产MBL铜绿假单胞菌，挑取少量细菌稀释在生理盐水中，使浓度为1.5×108CFU/ml，将菌液均匀涂抹于MH平板上，MH平板上一侧贴滤纸片，并加10μl EDTA(100mmol/L)，滤纸两边1.5cm处分别贴30μg头孢他啶(CAZ)和10μg亚胺培南(IPM)药敏纸片，在平板另一侧贴上述3种纸片做对照，将MH平板置37℃孵箱过夜，EDTA滤纸和临近的CAZ或IPM纸片之间出现明显的抑菌环扩大现象，判断为MBL阳性。

    1.3  产MBL铜绿假单胞菌的药敏试验

    选用的抗生素药敏纸片有：头孢噻肟(CTX)、头孢曲松(CRO)、替卡西林/克拉维酸(TIPC/CA)、哌拉西林/三唑巴坦(PIPC/TB)、头孢他啶(CAZ)、环丙沙星(CPLX)、头孢哌酮/舒巴坦(CPZ/SB)、头孢吡肟(CPE)、亚胺培南(IPM)、阿米卡星(AMK)。根据2005年CLSI标准判定。

    1.4  ERIC-PCR检测菌株的基因型

    基因组DNA的抽提［2，3］：取200μl过夜培养的铜绿假单胞菌离心，沉淀加入200μl的无菌水，涡旋混匀，100℃煮沸8min，室温离心8000r/min×10min，弃沉淀，上清液为模板，-20℃保存。PCR扩增：ERIC-PCR扩增引物(ERIC2)［4］：5′-AAGTAAGTGAC-TGGGGTGAGCG-3′。使用梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)。PCR体积为50μl，含10×PCR缓冲液5μl，200μmol/L dNTP，1.5mmol/L MgCl2，1μmol/L引物，0.02U/μl Ex Taq酶，2μl DNA模板。反应条件：94℃预变性4min，然后94℃ 60s，57℃ 60s，72℃ 90s，共循环35次，最后72℃延伸10min。取PCR产物5μl在1.8%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色成像。

    1.5  同源性判定标准

    应用BioNumerics 4.61软件对图像进行分析［5，6］，聚类图类型，选择UPGMA(unweighted pair group method using arithmetic averages)方法，条带位置差异容许度选择1.7%，优化值选择0.5%，凡相似度的值大于80%者为同一亚型，代表同一克隆株，小于80%者为不同的基因型，代表不同的克隆株，分别依次命名为A、B、C和D型。

    2.1  产MBL菌筛选

    23株铜绿假单胞菌中有18株产MBL。MBL阳性菌株的结果表现为EDTA的纸片和临近的CAZ或IPM纸片之间出现明显的抑菌环扩大现象；MBL阴性菌株则表现为EDTA纸片和临近的CAZ或IPM纸片之间无抑菌环或无明显的抑菌环扩大现象。

    2.2  药敏试验结果

    18株菌对头孢噻肟、头孢曲松、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦和头孢他啶完全耐药，对环丙沙星、哌拉西林/三唑巴坦、头孢吡肟、亚胺培南和阿米卡星5种抗菌药物的耐药率在83.3%～94.4%之间。18株MBL阳性株对10种抗菌药物表现出7种耐药模式，分别描述为a、b、c、d、e、f和g型(Tab.1)。

    2.3  ERIC-PCR结果

    由Fig.1可见，PCR产物多呈现为7～10条带，主带为5～7条，范围从100bp～2000bp不等，相似度在80%以上的菌株认为是相同的菌株，相似度低于80%时，可认为流行病学不相关，18株铜绿假单胞菌表现为4种基因型，分别描述为A、B、C和D型，以A型最多，有15株。

    2.4  细菌耐药模式和基因型之间的关系

    从Tab.1可见，18株MBL阳性株中，有15株为同一基因型，且A型在4～6月份内均有检出，患者都有机械辅助通气史，在细菌耐药模式上，11株菌表现为完全耐药，7株菌表现为多重耐药，其药敏差别主要体现在对哌拉西林/三唑巴坦、阿米卡星或亚胺培南3种抗生素上，其余3株MBL均为独立、单一的基因型。由耐药模式看，11株a型均为同一克隆株，对所有10种抗菌药物全部耐药，其余7株菌则表现为独立的耐药模式，其中c、d、e和f这4种耐药模式亦来自该克隆株，只是对哌拉西林/三唑巴坦、阿米卡星和亚胺培南3种抗生素的敏感度稍有不同。

    2005年4月至2005年6月，该ICU患者深部痰持续分离出多重耐药的铜绿假单胞菌，并且发现其对青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类等种抗生素几乎完全耐药，少数仅对环丙沙星和阿米卡星敏感或中介。进一步研究显示，这些菌株产MBL菌的分离率高达83.3%。为了解该ICU是否有铜绿假单胞菌的暴发流行，进行了分子流行病学的调查。本研究采用ERIC-PCR的结果表明，18株来自ICU的MBL阳性株表现为4种基因型，有15株为同一基因型，且在4～6月份内均有检出，表明该院ICU产MBL铜绿假单胞菌感染在2005年第二季度出现暴发流行。据有关文献报道［7～9］，希腊、韩国、巴西等国家的医院均出现过产MBL铜绿假单胞菌的大暴发流行；国内亦有关于耐亚胺培南铜绿假单胞菌引起的院内感染的报道［10］。克隆株能在该ICU内持续流行，可能通过以下途径：①呼吸机途径。本次调查的患者在采集标本前均有机械辅助通气48h以上，据报道［11］，机械通气后细菌感染大多数为条件致病菌，主要为假单胞菌(占37.5%)，这是由于气管插管及气管切开破坏了气道粘膜的正常保护作用，增加了感染的风险；②运用纤维支气管镜检查、吸痰导致院内传播，据Kirschke等［12］报道，由于纤维支气管镜设计、制造上的缺陷使得消毒不彻底导致铜绿假单胞菌的院内感染，使铜绿假单胞菌的分离率增高至47%，且经PFGE鉴定均为同一克隆株；③医务人员手的清洁与消毒。文献［13］报道，医务人员在为患者做各种治疗护理操作后，如未注意，直接触碰另一患者，则细菌可通过手部传播给另一患者，导致同一克隆菌株在院内播散。总之，由于ICU患者病情重，多有免疫功能低下，对病原菌的抵抗力较低，易合并机会致病菌的感染，因此进一步加强对产MBL感染菌株基因型的监测十分必要。

    本研究中18株MBL阳性株对10种抗菌药物表现出7种耐药模式，不但同一种耐药模式可表现为不同的基因型，而且不同耐药模式可有相同的基因型，表明细菌耐药模式和基因型之间也无明确相关性，因此要通过耐药模式来对细菌进行流行病学分型的方法并不可行。本调查中，11株耐药模式为a型的菌株来自同一克隆株，因此，在临床的检测中，如发现同一时期大多数菌株出现同一耐药模式，特别是多重耐药菌株，应高度警惕该菌株是否有暴发流行，进一步作分子流行病学的调查。

    检测MBL的方法有MBL-E试条、纸片协同法、PCR等，分别在基因和蛋白表达的水平上进行检测。由于铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制较多［14］，故仅选用亚胺培南做纸片协同法检测MBL时可能出现假阴性的结果。另据Shibata等［15］报道，当产MBL菌株可产大量的ESBL、AmpC或CMY酶，又伴有膜的改变时，CAZ纸片周围亦可不出现明显的生长抑制带，因此同时使用CAZ和IPM纸片可使阳性率明显增高。本文中23株菌除了用纸片协同法检测MBL，同时也用PCR法验证，均获得相同结果(该内容将另文发表)。由于纸片协同法检测MBL成本低，方法简单、快捷，因此适合在普通实验室开展和临床对产MBL菌的筛选、检测。

检测细菌基因型的方法较多，包括PFGE、RAPD、REP、ERIC和RFLP等，均为基于PCR和核酸电泳技术的分型方法。Liu等［16］用ERIC-PCR和PFGE两种方法对比检测23株临床分离的洋葱伯克霍尔德菌基因型，发现ERIC-PCR的重复性和区分能力同PFGE非常相近，但ERIC-PCR操作更简便。本实验通过预实验优化PCR条件，采用57℃的退火温度，扩增出分辨性好的5～7条带也达到实验目的，总之ERIC-PCR方法具有操作简单、成本低、分辨效果好、可重复性好等优点，适用于细菌基因型的辨别，便于临床进行分子流行病学监测。

 

  作者：伍晓锋 黎毅敏 卓超 袁锦屏 杨灵 任筱《中国抗生素杂志》

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