【摘要】  　　目的比较黄连、知母、七叶一枝花、黄芩、大黄、五倍子对都柏林念珠菌的体外抗菌活性。方法采用出芽实验法、肉汤微量稀释法和传统的琼脂扩散法。结果都柏林念珠菌对黄连、知母、七叶一枝花、黄芩敏感，抑菌圈直径在23~28 mm之间，MIC分别是：0.06~0.125，0.06~0.125，0.125~0.25，0.25~0.5 g/ml。黄连、知母、黄芩、大黄抑制出芽效果更好。结论黄连、知母、黄芩对都柏林念珠菌具有较好的抑菌效果，且抑制都柏林念珠菌出芽效果也较好。

【关键词】  中草药 都柏林念珠菌 抗菌活性 出芽实验法

　　Abstract：ObjectiveTo compare six Chinese herbal medicine' antimicrobial activity on Candida dubliniensis. MethodsThe methods of agar plate diffusions ,tube continuous dilution and germinative test were adopted.ResultsCoptis chinensis Franch，Anemarrhena asphodeloidses Bunge，Paris poludhulla Smith,Scutellaraia baicalensis Georgi  had good antimicrobial activity on Candida dubliniensis, the diameter of bacteriosestatic circle was between 23 and 28 millimetreand the MIC was 0.06~0.125，0.06~0.125，0.125~0.25，0.25~0.5 g/ml.Coptis chinensis Franch，Anemarrhena asphodeloidses Bunge，Scutellaraia baicalensis Georgi，R.offiainale Baill had good effect in germinative test.ConclusionCoptis chinensis Franch，Anemarrhena asphodeloidses Bunge，Scutellaraia baicalensis Georgi have good antimicrobial activity on Candida dubliniensis,and have good effect in germinative test.

　　Key words：Chinese herbal medicine；  Candida dubliniensis；  Antimicrobial activity；  Germinative test

　　都柏林念珠菌是1995年由Sullivan等在爱尔兰共和国的都柏林大学报告为一组具有非典型特征的假丝酵母菌，命名为都柏林念珠菌［1，2］，该菌种在人类免疫缺陷病毒感染者和艾滋病患者的口腔中分离率高达19％ ～32％，在其他人群口腔中的分离率为3％ ～14．6％［3~5］ ，临床上观察到都柏林念珠菌主要引起免疫缺陷患者的口咽部感染，较少引起其他部位及全身播散性感染［6，7］。目前临床上仍常用制霉菌素、酮康唑等西药，有报道出现耐药性［8~10］。因都柏林念珠菌的培养特性、染色形态及许多生物学特性与白念珠菌非常相似，本实验选用对白念珠菌具有较好抑菌效果的黄连、知母、七叶一枝花、黄芩、大黄、五倍子［11，12］，采用芽管实验法［13，14］、美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)M27-A方案［15］和传统的琼脂扩散法，综合比较出黄连、知母、七叶一枝花、黄芩、大黄、五倍子对都柏林假丝酵母菌的抑菌强弱，从而为今后中草药复方治疗都柏林假丝酵母菌性口腔疾患提供理论依据。

　　1  材料

　　1.1  中草药提取物的制备 取干燥中草药（均购自赣州市医药公司）400 g，加双蒸水过液面2 cm，煮沸两次。30 min/次，合并滤液，浓缩至200 ml。加3倍量50％的乙醇，放冰箱静置过夜，次日减压过滤，并回收滤液中乙醇，继续浓缩滤液得无醇味的提取物。提取物加双蒸水至100 ml使药液为相当生药4 g/ml。置冰箱中备用。

　　1.2  菌株  都柏林念珠菌标准菌株（CCCCMIDC8a），购于南京中国医学科学院皮肤病研究所。

　　1.3  菌液的制备菌株在沙保葡萄糖琼脂（Sabouraud dextrose agar）上进行传代培养后用于检测。分光光度计在530nm处检测接种菌悬液，调节浓度至1.0×106细胞/ml,稀释100倍备用。

　　2  方法

　　2.1  琼脂扩散法用无菌棉签沾取菌液在沙氏琼脂平板上作均匀密集划线，待菌液干燥后，用外径5 mm的打孔器打孔，每孔加药液200 μl，平放在37℃霉菌培养箱中培养35 h，观察结果，测量抑菌圈直径。抑菌圈直径取两次实验结果的平均值。

　　2.2  肉汤微量稀释法根据实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI,NCCLS）的M27-A标准，采用肉汤微量稀释法在含2%葡萄糖的RPMI中进行抗真菌药敏检测。取小号试管8支，编号。第1步每支管各加1ml肉汤培养基，然后在第1管加1 ml药液，用吸管在第1管吹数次，使药液与肉汤培养基混匀，取出1 ml加于第2管，混匀取出1ml加于第3管，如此稀释到第7管弃去1 ml，第8管不加药液作为对照。第3步每管加菌液50 μl，混匀，置37℃温箱中培养35 h。然后从每管中取出一接种环接种于沙氏培养基上，再继续培养35 h，观察结果。MIC定义为导致菌株生长被完全抑制的最低药物浓度。

　　2.3  芽管实验法对照管：正常人血清0.5 ml，生理盐水0.5 ml，菌液0.1 ml；试验管：正常人血清0.5 ml，试验药液0.5 ml，菌液0.1 ml。对照与实验管的菌液取自同一管，菌液浓度约为1×108细胞/ml。37℃霉菌箱中培养35 h，压滴法光镜400×随机观察数个视野，细胞数约为80~120个/视野为合适。结果判定：统计芽管与假菌丝形成的百分率，即压滴法美兰染色计数100个细胞，记录形成芽管与假菌丝的细胞数。每种药物观察3个视野，取平均值。

　3  结果

　　3.1  琼脂扩散法都柏林念珠菌对黄连、知母、七叶一枝花、黄芩比较敏感，其中黄连、知母的体外抑菌效果最好。结果见表1。

　　3.2  肉汤微量稀释法测定结果见表2。

　　3.3  芽管实验法结果见表3。

　　表1  琼脂扩散法量取的抑菌圈直径（略）

　　表2  肉汤微量稀释法测定的MIC范围（略）

　　表3  芽管实验法形成芽管与假菌丝的细胞百分数（略）

　　4  讨论

　　越来越多的研究显示部分都柏林念珠菌对唑类药物具有剂量依赖敏感或耐药。该菌能在体外对氟康唑迅速产生稳定的耐药性，且这种耐药性不会因在不含氟康哇的培养基上传代丢失［16］。本研究选用的黄连、知母、七叶一枝花、黄芩、大黄、五倍子这6种中草药都具有清热解毒，消肿化淤的功效，对白色念珠菌有较好的体外抑菌效果［11,12］，但这些中草药在抗都柏林念珠菌方面国内外未见文献报道。本研究显示黄连、知母、七叶一枝花、黄芩对都柏林念珠菌具有较好的抑菌作用，这些药物可否组成复方作为治疗都柏林念珠菌感染的临床新选择，还需做进一步的研究。

　　琼脂扩散实验是常用的药物筛选方法之一，但由于都柏林念珠菌在琼脂培养基上主要为酵母相，故该法只反映药物抑制了都柏林念珠菌酵母相的生长，而不能反映药物对都柏林念珠菌菌丝相的影响。为此，本研究将芽管试验应用于抗都柏林念珠菌中草药的筛选，其依据是都柏林念珠菌在含有血清的培养基可由酵母相发育为菌丝相，当加入试验药物后，可阻止都柏林念珠菌发育为芽管或假菌丝，从而能反映药物对都柏林念珠菌致病物质的影响，对药物的筛选有重要意义。本实验结果显示：黄连、知母、黄芩、大黄抑制出芽效果较好。具体抑制出芽的机理有待进一步研究。

本实验采用出芽实验法、肉汤微量稀释法和传统的琼脂扩散法综合比较黄连、知母、七叶一枝花、黄芩、大黄、五倍子对都柏林念珠菌的体外抗菌活性，结果显示，黄连、知母、黄芩对都柏林念珠菌具有较好的抑菌效果，且抑制都柏林念珠菌出芽效果也较好。

  作者：王小丽 钟有添 马廉兰《时珍国医国药》

【参考文献】

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　　［2］ 秦振宇，吴绍熙，谭升顺，等.都柏林念珠菌的国内首次分离［J］.临床皮肤科杂志, 1999,28(4)：213.

　　［3］ Moran GP,Sullivan DJ,Herman MC, et al. Antifungal drugs susceptibilities of oral Candida dubliniensis isolates from human immunodeficiency virus(HIV)-ifected and non-HIV-ifected subjects and generation of stable fluccnazole-resistant derivatives in vitro［J］.Antimicrob Agents Chemother，1997,41:617.

　　［4］ Kim JO，Garofalo L，Blecker-Shelly D,et a1．Candida dubliniensis infections in a pediatric population： retrospective identification from clinical laboratory isolates of Candida albicans［J］Clin Microbio1,2003,41:3354.

　　［5］ Cardenes-Perera CD，Torres-Lana A，Alonso-Vargas R, et a1．evalsuation of API ID 32C and VITEK-2 to identify Candida dubliniensis［J］.Diagn Microbiol Infect Dis ,2004,50:219.

　　［6］ Kibbler CC，Seaton S，Barnes RA，et a1．Management and outcomeof bloodstream infections due to Candida species in England and Wales［J］.Hosp Infect ,2003,54:l8.

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　　［11］ 马廉兰，钟有添.六种中草药对深部感染真菌的体外抑菌效果［J］赣南医学院学报, 2001,21(1):215.

　　［12］ 马廉兰，李坊贞，王小丽，等.黄连与知母对七种念珠菌的体外抗菌作用［J］.中华临床药学杂志, 2002,3(10): 18.

　　［13］ 章强强.检测白念珠菌芽管形成的新方法［J］.中华皮肤科杂志,1995,28(6):407.

 　　［14］ 马廉兰，刘志春，王小丽，等.芽管试验法与琼脂扩散法同步筛选抗白念珠菌中草药［J］.赣南医学院学报, 2004, 4(2):361.

　　［15］ National committee for clinical laboratory standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast;Approved Standard M27-A.Lancaster Avenue,Villanova.Pennsylvania:NCCLS,1997,1.

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