摘  要

 

　　全球性的细菌抗生素耐药是近年来感染性疾病治疗所面临的一大难题[1][2]，细菌可对某类抗菌药物产生耐药性，也可同时对多种化学结构各异的抗菌药物耐药。随着各种新型抗生素在临床的应用，细菌的耐药也越来越广。本文对细菌耐药机制及自动化仪器检测耐药机理等方面的新进展作简要综述。

 　　一、耐药性的分类：

　　细菌耐药性可分为：（1）天然或突变产生的耐药，即染色体遗传基因介导的耐药。属于此种耐药性者如肺炎克雷伯菌和催产克雷伯菌可产生由染色体介导的青霉素酶，因而对氨苄西林和羧苄西林耐药等。（2）质粒介导的耐药性，即细菌因获得了由质粒、噬菌体或其他外来DNA片段，所致的细菌耐药，其所带的耐药基因易于传播，在临床上占有重要地位。

　　二、细菌的耐药机制：

　　（一）β内酰胺类药物耐药

　　针对β内酰胺类抗生素的耐药机制主要有：产生β内酰胺酶；青霉素结合蛋白（PBP）的作用位点改变或产生新的对β内酰胺类抗生素不敏感的PBP；革兰阴性细菌外膜通透性降低和主动外排系统将抗生素泵出胞外。PBPs改变是革兰氏阳性菌耐β－内酰胺类抗生素的最主要机制，β－内酰胺酶是革兰氏阴性杆菌耐β－内酰胺类抗生素的最普遍的机制。

　　（二）β内酰胺酶介导的细菌耐药

　　β内酰胺酶早在β内酰胺类抗生素应用于临床前便已发现，它并不是细菌生长所必需的，因为它的唯一功能是水解β内酰胺。革兰阳性菌的β内酰胺酶分泌到细胞外，而革兰阴性菌的β内酰胺分泌到胞周间隙[3]。最近Bush更新的版本，结合酶的分子结构、抑制特性及水解底物特征来进行分类。见下表

　　（1）β内酰胺的作用机制：

β内酰胺是结构类似于细胞壁前体肽聚糖肽酰－D丙氨酰基－D－丙氨酸未端的类似体，能与PBPs和β内酰胺酶互相反应，β内酰胺结合物，PBPs和β内酰胺酶经过连续的酰化作用和脱酰基作用反应，β内酰胺环发生亲核攻击使环打开，并形成通过脂键相连的乙酰酶中间体；通常PBP和β内酰胺酶的主要区别在于酰基化的速率不同，这主要是因为它们对水分子的依赖性不同。对β内酰胺酶来说，水分子是有效的亲核攻击分子，它能迅速水解乙酰酶中间体的脂键使酶再生，并释放β内酰胺部分，细菌产生耐药性。而对PBP来说，乙酰酶中间体对水分子的亲和攻击不敏感，因而乙酰酶中间体不能被水解或水解的速率很慢，从而使PBP失活。

　　（2）革兰阳性菌β内酰胺酶介导的细菌耐药：

　　在青霉素G应用于临床不久，β内酰胺酶便在葡萄球菌中广泛分布。目前90％以上的金黄色葡萄球菌中的β内酰胺酶属于Bush分类的2a组。与革兰阴性菌β内酰胺酶不同，尽管面临着对β内酰胺酶稳定的抗生素的选择性压力，几十年来金黄色葡萄球菌中的产β内酰胺酶、对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌仍然对半合成青霉素（如苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林等）、头孢菌素及碳青酶烯类抗生素敏感。金黄色葡萄球菌β内酰胺酶的产生通常是可诱导的，共涉及至三个基因：blaⅠ、blaR1和blaR2。blaⅠ编码一种抑制因子，对β内酰胺酶结构基因blaZ的转录进行负调节；blaR1编码的蛋白BlaR1包括一个细胞外的区域用来感受β内酰胺类药物，一个细胞内区域负责产生一种信号导致blaZ的去抑制；blaR2基因下调β内酰胺酶的表达，其机制不明。

　　（3）革兰阴性菌β内酰胺酶介导的细菌耐药：

　　尽管革兰阴性菌种发现了多种酶，TEM－1和SHV－1分别是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中最主要和最多见的酶。这些分布广泛的酶属于Bush分类2b组，由质粒介导，通过接合、转化和转导等形式使耐药基因在细菌中扩散，可有效地水解青霉素和窄谱头孢菌素酶，但不能水解广谱的氧亚胺头孢菌素、头霉素和碳青酶烯类抗生素，即使这些酶过度表达也不能介导细菌对上述抗生素的耐药，但可导致细菌对酶抑制剂的耐药。

　　20世纪80年代初，随着三代头孢菌素的临床应用，多年来一直稳定的TEM－1和SHV－1酶突然加快了突变的步伐，短短几年由于这两种酶的某些位点的突变而形成的各种超广谱β内酰胺酶在世界各地不断被发现；这些酶介导的细菌对青霉素和一、二、三代头孢菌素以及单环菌素耐药，但对头霉素、碳青酶烯及酶抑制剂敏感，属于Bush分类2b组。从ESBL的分子结构看，其活性作用位点丝氨酸－70位于由四段氨基酸保守序列围成的催化腔底部，β内酰胺类抗生素只有进入催化腔的底部才能被酶水解。ESBL的突变位点一般位于上述保守序列的周围，目前已发现的几十种ESBL其突变位点主要集中在TEM－104、－164、238、－240位点和SHV－179、－238、－240位点，其中164、179、238位点中任一点的突变都将导致催化腔体积的增大，使分子结构较大的三代头孢菌素能够进入；在此基础上104、240等位点的突变将酶对三代头孢菌素的亲和力增强，从而进一步提高其水解效率。另外突变的位点不同其水解效率也不同，如238位点的突变主要促进酶对头孢噻肟的水解，而240、104等位点的突变主要促进酶对头孢他啶的水解，所以抗生素的使用情况不同，ESBL的类型在不同国家和地区是不同的。

　　XTX－M系列ESBL是近年来在世界各地被发现的非TEM和非SHV起源的ESBL，包括CTX－M1－10、Toho－1和Toho－2，它们的主要特征是对头孢噻肟水解力强，而对头孢他啶水解力弱，因此体外药敏试验中产生此酶的菌株常对头孢噻肟耐药而对头孢他啶较敏感。三代头孢菌素的广泛使用引起细菌产生多种新的β内酰胺酶，其中以超广谱β内酰胺酶最具重要意义，主要由肠杆菌科细菌，尤其大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产生；大多由编码TEM－1基因和SHV－1基因突变而形成；多数可为β内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。它可以水解青霉素类、一代、二代、三代头孢菌素和氨曲南，导致细菌对第一代、第三代头孢菌素、替卡西林、哌拉西林和氨曲南耐药，有趣的是，这些酶大多数可被棒酸及舒巴坦抑制，克雷伯菌例外，头霉菌素和碳青霉烯不受影响[3][13][14]。由于其可传播性和对三代头孢菌素表现敏感而引起误导治疗问题，被认为是革兰氏阴性杆菌中最危险的耐药形式[15]，且它的产生使治疗更加困难，抗菌药物的选择范围更窄，目前多选用亚胺培南治疗，ESBL阳性的革兰阴性杆菌应在报告注明，提示医生勿用β－内酰胺类药物。ESBL主要在肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中出现，然后又在假单胞菌、不动杆菌、流感嗜血杆菌和奈瑟菌中发现[13][16][17]。当怀疑产ESBL或经验用药治疗失败时，应考虑ESBL产生，避免使用除头霉菌素、卡巴培能以外的其它头孢菌素[18]。

　　AmpC酶的耐药机制：

　　AmpC酶是由染色体介导的β内酰胺酶，属于Bush分类1组（C类），在自然状态下细菌产生此种酶的量很少，但某些细菌如阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌等在β内酰胺类抗生素（尤其是头孢西叮、亚胺配能和克拉维酸）的作用下可大量诱导AmpC酶的产生，而且其调控基因的突变率很高，突变后将使酶持续大量产生，导致细菌对除碳青酶烯类之外的所有β内酰胺类抗生素耐药。AmpC酶的诱导机制很复杂，共涉及四个连续基因，即ampC、ampR、ampD和ampG，并与细菌细胞壁肽聚糖的循环合成有关。近年来此耐药基因已开始向质粒扩散，给临床带来更严峻的挑战。近年也有少数质粒介导的AmpC酶在不同国家被发现。AmpC酶属于Class C类酶[3]又称头孢菌素酶，它是Bush1类β内酰胺酶的典型代表，能水解青霉素类，一代、二代和三代头孢菌素类和单环类，不被克拉维酸抑制，体外试验尚能诱导细菌产AmpC酶[19]，舒巴坦和他唑巴坦的抑制效果非常有限[20]，但硼酸类化合物和氯唑西林体外有较好的抑制作用。AmpC酶可分为诱导型，去阻遏持续高产型和质粒型。绝大多数革兰阴性杆菌都具有产生AmpC酶的能力，通常情况产酶量很少，在临床上并不形成耐药，但一旦细菌阻遏AmpC酶产生的基因发生突变，细菌就可持续高产AmpC酶，出现对绝大多数β内酰胺抗生素的耐药。此外还应注意到在传统认为只产AmpC酶的肠杆菌属细菌中，ESBL可能并不少见，细菌一旦同时具有高产AmpC酶及产ESBL的能力，其耐药性将极其严重。

　　诱导型AmpC酶：当细菌未接触有诱导力的β内酰胺类抗生素时，染色体的ampC基因被基因阻遏子抑制，产酶处于基线水平。当使用有诱导力的抗生素治疗时，产生了暂时的去阻遏现象。AmpC基因自由表达，使得细菌暂时产生过量的β内酰胺酶。一旦去除抗生素，大多数情况下产酶水平水逐渐恢复到基线水平。临床应用β内酰胺类抗生素阻断了细菌细胞壁五肽交朕桥连接，引起肽聚糖合成紊乱，产生大量肽聚糖片断，当革兰阴性菌周质间隙或胞浆中肽聚糖片段的量超过AmpD蛋白循环利用能力时，感受器或跨膜转运系统AmpG蛋白可传递或摄取肽聚肽聚糖片段的刺激信号，使AmpR蛋白形成激活子，激活ampC基因转录及ampR基因自我转录，诱导细菌产生AmpC酶。大肠埃希菌的AmpC酶低水平表达，它缺少ampR基因而不能诱导产酶[21]。

　　去阻遏持续高产AmpC酶：在产诱导型AmpC酶的革兰阴性菌中，可发生较高频率的调节基因自发突变，调节基因的作用受到抑制[22]，AmpD调节基因突变产生有缺陷的AmpD蛋白，使菌株去阻遏持续高产AmpC酶，亦可产生高诱导型或温度敏感型AmpC酶[23]。

　　质粒型AmpC酶：20世纪80年代以前，AmpC酶多数报道为染色体型，20世纪80年代后有许多文献证实大量使用三代头孢菌素与AmpC酶的产生有密切关系。质粒型AmpC酶的出现与头霉菌素（如头孢西丁和头孢替坦），加β内酰胺酶抑制剂复合抗生素使用量增多产生的选择压力有一定的关系，从分子大小、结构、等电点、生化特性等非常类似于染色体酶，这种酶较超广谱β内酰胺酶有更广泛的耐药谱，又不能酶抑制剂类破坏[24、25]。

　　1988年，Papanicolaou等首次在肺炎克雷伯菌的质粒上捕获到头孢菌素酶，这种耐药性可以转移，并与阴沟肠杆菌ampC基因同源。1994年，在弗劳地枸橼酸杆菌中发现携带头孢菌素酶的耐药质粒，可以转移至大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中，并编码产生AmpC酶，形成质粒型AmpC酶，增加了传播力。目前质粒介导的AmpC酶种类也在不断地增加，现已发现了26种质粒AmpC酶[25]。

　　随着20世纪80年代早期以来新的β内酰胺酶类抗生素的广泛使用，产AmpC酶的革兰阴性杆菌已逐渐成为医院感染的流行菌[4]。1978年首次报道了应用新的β内酰胺类抗生素过程中筛选出产生高水平染色体酶的变异株[26]，它几乎对当前所有的β内酰胺类抗生素（除亚胺培南外）耐药。这种耐药性已在肠杆菌属、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根菌属、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌等临床分离株中报道，并涉及每一种新的头孢菌素类、部分青霉素类和氨曲南[27]。这类报道大多数是肠杆菌属细菌引起的感染。在美国，肠杆菌属造成的医院感染菌血症占5％至7％；在ICU，分别占常见呼吸道感染的第三位，尿路感染第五位，手术伤口感染第四位[28]。其中最常见是阴沟肠杆菌和产所肠杆菌感染，特别当存在以下危险因素时，如长期住院（尤其ICU），严重的基础疾病，各种原因的免疫抑制、高龄、导管装置、抗生素使用等。肠杆菌属感染的爆发流行主要发生在大量使用头孢菌素和其他广谱β内酰胺类抗生素的肿瘤病房或新生儿、心脏外科的ICU。造成感染爆发流行的多种细菌来源于病人自身的肠道菌群。正是由于使用原有的或新的头孢菌素而形成的选择性压力，肠杆菌属细菌逐渐成为肠道菌中的优势菌，最终造成许多病人感染。不仅产AmpC酶的肠杆菌科细菌在医院的流行呈上升趋势，而且这些细菌形成多重耐药的趋势也不断上升。1991年，Chow等[27]对129例成年人研究发现，在肠杆菌属细菌所致的菌血症中，使用第三代头孢菌素治疗比使用氨基糖苷类或其他β内酰胺类治疗更容易导致多重耐药性的产生。这主要与新的头孢菌素的使用增加，以及医院的规模和病人数密切相关。但这种趋势是可以改变的，当减少或终止头孢菌素类的使用时，可减少产诱导酶的肠杆菌科细菌的流行和耐药菌株的出现[27]。

　　2、PBP改变介导的细菌耐药：

　　青霉素结合蛋白（PBP）位于细菌细胞质膜外壁，是在细菌细胞壁肽聚糖合成后期起转肽酶、转糖苷酶、肽链内切酶及羧基肽酶等的作用的一系列酶，它们也是β内酰胺类抗生素的作用靶位。几乎所有细菌都具有3－8种PBP，其命名以数字表示（如PBP1、2、3等）：分子量越大数字越小。需注意的是，在不同属或种的细菌中，尽管命名的数字相同，但它们并不一定相关。β内酰胺类抗生素一般具有多个潜在的作用靶位，因为2－4个PBP是细菌生存所必需的[3]。

　　（1）革兰阳性菌PBP改变介导的细菌耐药：

　　PSP改变包括获得新的对抗生素低亲和力的PBP和本身发生修饰导致对抗生素的亲和力下降的PBP，前者主要发生在葡萄球菌中，后者主要发生在肺炎链球菌中。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）对所有β内酰胺类抗生素均耐药，其原因是由于获得了未知起源的DNA编码的新的耐β内酰胺PBP，它由染色体mecA基因编码，被命名为PBP2a。

　　MecA基因的表型表达受多种因素的影响，包括PH、温度、渗透性、上游调节序列和其他不相关染色体基因。有些MRSA的mecA基因上游存在着调控基因mecR1和mecI，其序列和功能分别与β内酰胺酶的调控基因blaR1和blaI 相似，对mecA的表达进行负调控。MecA基因的转录，即PBP2a的表达有三种形式：（1）非诱导持续表达型，此型MRSA缺少mecR1－mecI基因和β内酰胺酶质粒；（2）即诱导型，此型MRSA缺少mecR1－mecI基因而具有β内酰胺酶质粒，通过β内酰胺酶的调控基因blaR1和blaI调控mecA的表达；（3）延迟表达型，此型MRSA具有mecR1－mecI基因，其耐药性在甲氧西林诱导后48小时才能充分表达，临床常规药敏试验常误将此型菌株判断为敏感，因此具有重要的临床意义，另外，除mecA基因外甲氧西林的耐药还与fem基因（包括femA、B、C、D、E、F等）的表达有关。Fem的功能是直接或间接参与细菌细胞壁的生物合成，不影响PBP2a的生成，但其缺失将导致细菌对甲氧西林的耐药性降低。

　　肺炎链球菌不产生β内酰胺酶，其对β内酰胺类抗生素的耐药是由于PBP（主要是PBP2）发生改变而导致对β内酰胺的亲和力降低。肺炎链球菌包括6种PBP（1a、1b、2a、2x、2b和3），其青霉素敏感株的染色体pbq基因则变异较大，称为嵌合体基因，因为它包括敏感株相应部分基因和可能有相近菌种转化而来的基因。肺炎链球菌的耐药是一个连续突变的过程，单个突变会导致低水平耐药，而高水平耐药则是多个pbq基因连续突变的结果，如对广谱头孢菌素的耐药涉及到PBP1a、2x的改变。另外在不同抗生素的选择下其突变位点也不同，因此对广谱抗生素耐药并不一定对青霉素耐药。

　　粪肠球菌和屎肠球菌对低水平青霉素的固有耐药是由于具有青霉素低亲和力的PBP5，粪肠球菌中常见的高水平的耐药与PBP5过量产生和氨基酸突变有关。

　　（2）革兰阴性菌PBP改变介导的细菌耐药：

　　PBP改变介导的细菌耐药在革兰阴性菌中较少见，主要在铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、醋酸钙不动杆菌和脆弱类杆菌中。在淋病奈瑟菌（非TEM－产生株）中染色体倡导介导的高水平青霉素耐药与低亲和力PBP1、2的产生有关。

　　3、外膜渗透性降低和主动外排导致的β内酰胺耐药：

　　这种耐药主要见于革兰阴性菌。革兰阴性菌的外膜对β内酰胺类抗生素是一种屏障，抗生素的内流和清除（水解或捕获）之间平衡决定了细菌的敏感和耐药。在大肠埃希菌和其他阴性菌中β内酰胺类抗生素主要由亲水的膜蛋白孔道通过外膜，前者至少产生两种膜蛋白孔道，OmpF和OmpC。由于突变导致OmpF和/或OmpC改变或表达减少将使细菌对多种β内酰胺类抗生素敏感性下降。铜绿假单胞菌对多种β内酰胺类抗生素呈现固有的耐药性，长期以来将这种耐药性归结为该菌具有低通透性外膜。现在已认识到这种耐药性是由于能量依赖的主动外排系统[9－10]（MexAB－OprM）和低通透性外膜协同作用的结果，最近有资料显示MexAB－OprM系统通过外排可直接介导对β内酰胺类抗生素的耐药。

　　对于介导细菌多重耐药性的主动外排泵的研究则起于10年前对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌多重抗生素的研究[9]。近年的研究还发现许多革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌的细胞膜存在能量依赖性外排系统，使菌体内的药物量减少。尽管细菌耐药主动外排转运体种类众多，但是目前研究显示“耐受－－生节－－分裂家族”（RND类）的主动外排泵系统与细菌多重耐药性形成密切相关。RND药物外排系统普遍存在于革兰阴性杆菌中，如铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、分枝杆菌等，同时多种革兰阳性菌中都已发现与细菌耐药性形成有关的由细菌染色体编码的药物外排系统，如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌及枯草杆菌等。此外当细菌同时存在多种耐药机制时，不同的耐药机制彼此产生协同或相加作用共同提高细菌耐药水平。药物主动外排泵系统与其他细菌耐药机制具有协同作用提高细菌耐药水平，例如铜绿假单胞菌MexAB－OprM与其外膜屏障发挥明显的协同作用[11]。当有多种主动外排泵系统同时发表达时，外排作用可获加强[12]。

　　（三）氨基糖苷类耐药：

　　氨基糖苷类主要作用于需氧革兰阴性菌和革兰阳性球菌，对链球菌和肠球菌往往无效。天然氨基糖苷类耐药主要是药物的摄入减少，而获得性耐药主要产生质粒编码的修饰酶。此外获得性耐药也可通过染色体变异引起的核蛋白体靶位改变或抗生素摄入减少等产生。

　　1、摄入药物减少：抗生素摄入减少会引起细菌对所有氨基糖苷类天然或获得性低水平的交叉耐药。氨基糖苷类是一类分子量较大的复合物，它主要作用于细菌质核糖体，在作用靶位前要经过细菌外膜（革兰阴性菌）和胞质膜（革兰阴性菌和阳性菌）。在革兰阴性菌中，首先须通过离子结合，破坏外膜上阴离子物质，包括脂多糖、外膜蛋白和两端的磷脂。二价阳离子Mg离子和Ca离子是脂多糖和磷脂结合所必需，氨基糖苷类中的阳离子可取代二价Ca离子，使抗生素穿透胞膜进入胞浆。某些菌株对氨基糖苷类敏感性降低，就是因为一些离子转移系统缺陷，造成药物摄入减少，如肠球菌、链球菌和某些肠杆菌科细菌。

　　2、氨基糖苷的修饰酶：此酶是通过质粒介导由革兰阴性菌或部分阳性菌产生的钝化酶，能使氨基糖苷类抗生素失活，已知的钝化酶有三类：（1）乙酰转移酶（AAC），使游离羟基乙酰化；（2）核苷转移酶（ANT），使游离羟基核苷化；（3）磷酸转移酶（APH），使氨基糖苷类游离羟基磷酸化。其中，磷酸转移酶对抗生素的耐药性最高。一种钝化酶可产生不同的耐药表型。一种氨基糖苷类药物能被一种或多种酶所钝化，而几种氨基糖苷类药物也能被同一种酶所钝化。因此在不同的氨基糖苷药物间存在着不完全的交叉耐药性。产生钝化酶的质粒（或DNA片段），可通过接合方式在细菌细胞间转移，使原来不耐药的菌细胞产生耐药性。

　　3、核蛋白体靶位修饰：在大肠杆菌K－12菌株中，由于rpsl基因发生改变，使核蛋白体S12蛋白发生改变，而对链霉素产生很高的耐药性。因核蛋白体靶粒修饰改变产生对链霉素耐药的菌株还有淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌。耐链霉素的结核分枝杆菌也是由于16SrRNA和核蛋白体S12基因发生突变引起。

　　（四）大环内酯、林可霉素耐药：

　　在革兰阴性杆菌中，细胞壁外膜对疏水性药物的渗透性低是导致细菌对大环内酯类和林可霉素等抗生素固有耐药的原因，而获得性耐药多见于核糖体靶粒的改变及抗生素的灭活。

　　靶粒修饰：

　　大环内酯类抗生素与林可霉素的化学结构不同，但作用机制相似，它们能结合到50S核蛋白体亚基上，抑制肽链延长。对这些抗生素耐药常常因为获得erm基因（红霉素耐药的甲基化酶），erm基因编码产生的酶能将23SrRNA上一个特异性腺嘌呤残基6位双甲基化。对从实验室分离出的大量甲基化酶的分析中可以看出，这些酶修饰位于rRNA保留区中类类似的腺嘌呤残基，而核蛋白体的甲基化导致对大环内酯类和林可霉素交叉耐药。也可能是甲基化改变了核糖体的构象，通过使抗生素结合位点发生重叠而降低对抗生素的亲和力。

　　对大环内酯类抗生素和林可霉素耐经的表达可经诱导和构建得到。其表达类型和erm基因种类无关，而取决于甲基化酶结构基因中上游调节区，调节区域中单个核苷酸的置换、删除、复制可诱导出对大环内酯类和林可霉素交叉耐药的重组耐药株。

　　金黄色葡萄球菌的诱导性仅对大环内酯类中红霉素、盐酸红霉素、叠氮红霉素耐药、对螺旋霉素、交沙霉素等和林可霉素类依然敏感，产生对这类抗生素间不同的耐药性是由于红霉素、盐酸红霉素和叠氮红霉素能有效诱导甲基化酶的合成。链球菌的耐药同样也可通过诱导和重组获得。

　　在某些葡萄球菌中，对大环内酯类和林可霉素类抗生素的耐药株常由携带ermC决定因子的非结合型小质粒介导。除肺炎链球菌外，几乎在所有的链球菌都发现了耐药性质粒，在肺炎链球菌、牛链球菌、链球菌中证实质粒DNA缺失引起耐药性的转移。

　　抗生素灭活：靶粒修饰是对结构不同的抗生素的耐药，抗生素的酶灭活仅导致对结构相同药物的耐药。从口服红霉素的胃肠炎患者身上可分离到对红霉素高度耐药的肠杆菌，这些耐药株通过产生红霉素酯酶或通过2－磷酸转移酶催化的磷酸化反应破坏大环内酯类药物的酯环。现已发现由ereA和ereB基因编码的酯酶I和II，在对红霉素高度耐药的肠杆菌中经常发现ereA和ereB的复合物（编码rRNA甲基化酶），这也证实了两种基因产物之间的协同作用。临床上对林可霉素高度耐药多由产生核苷酸转移酶引起。

　　抗生素的活性泵出：当前约有15％－20％的肺炎链球菌和相当数量的化脓性链球菌对大环内酶类药物耐药，其耐药机制不是酶灭活作用，而是存在编码产生抗生素泵出系统的mefE和mefA决定因子。凝固酶阴性葡萄球菌对大环内酯类抗生素的耐药多由于产生ermC甲基化酶，但也有相当数量因为药物的活性泵出而导致耐药。金黄色葡萄球菌和部分凝固酶阴性葡萄球菌中msrA基因编码产生一种具有转运功能的蛋白，导致对大环内酯类抗生素耐药。

　　（五）四环素耐药：

　　自然界细菌对四环素耐药最为多见，其发生机制主要为获得外源性DNA编码产生四环素泵出系统，或具有核蛋白体保护作用的蛋白质，也可以因为染色体突变导致外膜渗透性降低。

　　1、渗透性改变：大肠埃希菌中染色体突变引起外膜蛋白OmpF减少，阻碍四环素进入菌体，导致对四环素耐药，在四环素存在下可以选择出对四环素及其他多种抗生素高度耐药的菌株。其耐药是因存在着多重耐药系统（MAR），包含marRAB操纵子，可减少OmpF外膜蛋白数量，这一操纵子也可被四环素抑制，同时mar操纵子的激活也可导致四环素的活性泵出，使耐药性增加，在肠杆菌科多种菌属如沙门菌属、志贺菌属、克雷伯菌属、枸橼酸菌属、肠杆菌属中都已检出mar系统。

　　2、药物泵出：菌体编码产生药物泵出系统是导致对四环素耐药的重要机制，这一过程由膜蛋白Tet通过摄入质子、排出四环素－阳离子复合物完成。通过DNA－DNA杂交，从临床菌株中可分离出8种编码泵出系统的基因：tet（A）—（E）基因在革兰阴性菌中广泛检测出；ter（P）基因存在于梭菌属细菌中，由编码功能基因tetA（P）和tetB （P）的复合基因组成，tetA（P）编码与泵出有关的膜转运蛋白，tetB（P）编码类似tetM的核蛋白体保护蛋白；tet（K）和tet（L）基因仅发现于革兰阳性菌。铜绿假单胞菌对包括四环素在内的许多抗生素固有耐药，其机制极可能是存在药物泵出系统。

　　3、核蛋白体保护作用：通过降低30S核蛋白体亚基A位点和P位点对氨基酰tRNA的亲和力，四环素发挥其抗菌作用。对四环素耐药通常可因产生一种蛋白质，这种蛋白质和核蛋白体相互作用，使蛋白质合成不受抗生素影响，称核蛋白体保护作用。核蛋白体保护作用可受到tRNA修饰的阻碍，具体机制尚未阐明。现已分离出5种核蛋白体保护作用基因：tetM、tetO、tetP、tetQ、tetS。TetM分布极为广泛，可在奈瑟菌属、金氏菌属、埃肯菌属和杜克嗜血杆菌中检出，在支原体及脲原体中也有发现，它更多作为Tn916相关的结合性转座子的一部份见于染色体上，这些转座子有自我转移性，宿主范围广，在四环素存在时转移频率增加，四环素可以调节增强其表达；tetO可在弯曲菌属、链球菌属和肠球菌属中检出；tetP在产气荚膜梭菌中检出；tetQ在类杆菌中检出；tetS在产单核细胞李斯物菌和粪肠球菌中发现。

　　（六）磺胺和甲氧嘧啶耐药：

　　1、固有耐药：外膜渗透性降低使铜绿假单胞菌对甲氧嘧啶和磺胺耐药；奈瑟菌属、梭菌属、布鲁菌属、类杆菌属、莫拉菌属、诺卡菌属以甲氧嘧啶固有耐药，是由于抗生素和细菌DHFR亲合力低；肠球菌属、乳杆菌属某些细菌属营养缺陷型细菌能利用外源性叶酸，表现出对磺胺和甲氧嘧啶低度敏感，肠球菌也可利用外源性胸腺嘧啶，不受叶酸合成途径拮抗剂的抑制。

　　2、对甲氧嘧啶获得性耐药：（1）染色体突变：在临床上常可见到DHFR结构基因突变引起对甲氧嘧啶耐药的菌株，如大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等，在肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌中发现染色体突变导致的外膜渗透性下降，及对萘啶酸、甲氧嘧啶、氯霉素交叉耐药。这些菌株多重耐药与外膜蛋白数量减少有关。染色体突变灭活胸苷酸合成酶，导致对磺胺甲氧嘧啶合成并高度耐药，这些突变株需要外源性胸苷或胸腺嘧啶合成DNA，对叶酸合成途径拮抗剂不敏感。（2）质粒介导耐药：导致肠杆菌科一些细菌对甲氧嘧啶高度耐药最常见原因是获得外源性DNA产生过量DHFR；产生的DHFR被甲氧嘧啶抑制的敏感性低于染色体介导的酶。在革兰阴性菌，尤其是大肠埃希菌中，通过动力学、一级结构分析、DNA－DNA杂交可至少分出6种不同的DHFR；相比之下，革兰阳性菌两型（S1和S2型）。

　　DHFR中分布最广泛的是DHFR I型，导致对甲氧嘧啶高度耐药，其相应基因dhfr I位于转座子Tn7，而且dhfr I基因是转动基因，能在Tn7转座子外检出，dhfr II 型对甲氧嘧啶敏感性最低；dhfrⅢ型在伤寒沙门菌和志贺菌属某些种检出，引起对甲氧嘧啶耐药；dhfr Ⅳ型能被甲氧嘧啶诱导。

　　在革兰阳性菌中，DHFR S1型普遍存在，在金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人型葡萄球菌中都已检出由dhfr A基因编码的DHFR S1型酶。近年在产单核细胞李斯特菌、溶血葡萄球菌中还发现了DHFR S2型酶，存在于葡萄球菌和李斯特菌中的S1型酶可能会表现出可移动性和突变性的特征，和染色体介导的表皮葡萄球菌的酶一样，因为二者氨基酸序列极为相似。

　　3、对磺胺获得性耐药：（1）染色体突变：在奈瑟菌属细菌和金黄色葡萄球菌中，染色体突变可导致PABA增多，产生对磺胺耐药。大肠埃希菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌的耐药与dhps基因突变有关，突变的dhps基因编码产生对磺胺低亲合力的DHPS。（2）质粒介导：获昨了编码产生耐药性DHPS的质粒可导致对磺胺获得性耐药。在革兰阴性菌中已分离出分别由sul I 和sul II基因编码的耐药性DHPS I型和II型。几乎所有的sul I基因和其他耐药基因相联，位于由大结合质粒携带的整合子保留片段上；sul II基因常和链霉素耐药基因相联，存在于宿主范围广的质粒和小的非结合性质粒上，在临床分离的耐药株中，sul I 和sul II基因检出率大致相同。

　　（七）喹诺酮类耐药：

　　1、DNA螺旋酶和拓朴异构酶Ⅳ的改变：在细菌生长和分裂中，DNA螺旋和拓朴异构酶Ⅳ有着非常重要的作用，喹诺酮作用于其上则起到抗菌作用。然而编码螺旋酶和拓朴异构酶亚基的基因发生突变可导致对喹诺酮耐药。

　　临床试验也已证明gyrA基因的突变引起对喹诺酮高度耐药，几乎所有gyrA耐药突变都位于喹诺酮耐药决定区的130bp序列中，在革兰阴性和阳性菌中都有发生；gyrB基因的突变也引起对喹诺酮的耐药，但程度不高。临床耐药株大多数由gyrA突变引起，另一因子parC的突变也会使耐药水平增强，但其突变发生于gyrA之后。

　　在革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌中，对氟喹诺酮的耐药也由gyrA和parC基因突变引起。相比革兰阴性菌而言，氟喹诺酮首先作用于革兰阳性菌拓朴异构酶Ⅳ，因而在对环丙沙星耐药的金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌中，parC的突变先于gyrA。这也提示革兰阴、阳性细菌parC突变有根本不同。

　　2、外膜渗透性降低及药物泵出：由外膜变化引起抗生素进入菌体中减少可导致对喹诺酮耐药，对喹诺酮耐药是多重耐药表型的一个特征，这一多重耐药和mar位点突变有关。在对铜绿假单胞菌的研究中已鉴定出多种位点，这些位点突变要改变外膜蛋白，从而降低渗透性导致耐药。在铜绿假单胞菌中还分离出因药物泵出表达耐药的菌株，对多种抗生素耐药。在金黄色葡萄球菌中也发现了活性泵出系统，由norA基因编码产生，该基因过量表达导致耐药。

　　（八）氯霉素耐药：

　　1、酶灭活作用：氯霉素有2个羟基，可被氯霉素转乙酰基酶乙酰化，在这反应中乙酰辅酶A为乙酰基供体。乙酰化作用先发生在C3羟基，形成3－乙酰氯霉素，在不需酶催化下3－乙酰氯霉素转位形成1－乙酰氯霉素，再乙酰化为1，3二乙酰氯霉素，一乙酰氯霉素和二乙酰氯霉素都不能结合到50S核蛋白体亚基上。通过对肠道细菌突变株的研究，发现不同突变株其氯霉素转乙酰基酶组成都是由相同亚基组成的三级结构。（1）革兰阳性菌中的氯霉素转乙酰基酶：在金黄色葡萄球菌中通过电泳技术现已分离出5种不同的氯霉素转乙酰基酶：A、B、C、D及由质粒PC194编码的氯霉素转乙酰基酶。编码酶的结构基因常位于小多拷贝质粒上，基表达可由氯霉素诱导；对氯霉素耐药的粪肠球菌和肺炎链球菌产生一种可诱导的氯霉素转乙酰基酶，产气荚膜梭菌有2个基本表达决定因子：catP和catQ。（2）：革兰阴性菌中氯霉素转乙酰基酶：在革兰阴性菌中，对氯霉素耐药的菌株常由质粒或转座子的基因诱导，这些基因常被完整表达，在肠道细菌中现已鉴定出了3个型别的酶（I、Ⅱ、Ⅲ型），I型酶普遍存在，能特异性紧密结合类固醇类抗生素，编码氯霉素转乙酰基酶1型的基因常位于Tn9转座子上。近来检出一群基因，能编码催化乙酰辅酶A到氯霉素，但其结构和典型的氯霉素转乙酰基酶不同，称为外来乙酰基转移酶，包括铜绿假单胞菌和肿胀土壤杆菌中染色体编码的酶。在大肠埃希菌多重耐药转座子Tn2424上发现一氯霉素耐药决定因子，编码产生XAT1、Tn2424和Tn21接近，其核苷酸序列区位于xat基因一侧，提示此耐药基因是整合子的一部分，与耐药基因的表达和播散有关。

　　2、渗透性降低：染色体突变导致外膜渗透性降低也会引起某些革兰阴性菌对氯霉素耐药，如在流感嗜血杆菌和伤寒沙门菌中，对氯霉素的高度耐药株主要与外膜蛋白数量下降及特异性外膜蛋白缺失有关；铜绿假单胞菌中cmlA基因可使外膜蛋白ompA和ompC表达减少，使进行菌体的氯霉素减少。

　　（九）糖肽类耐药：以下主要介绍肠球菌耐糖肽类抗生素的耐药机制，其中又以获得性耐药为主，获得性耐药的主要表型是VanA和VanB。

　　VanA型菌株主要由屎肠球菌和粪肠球菌分离得到，对万古霉素和肽可霉素高水平耐药，耐药性可通过接合转移给敏感菌株。VanA型耐药基因由11kb转座子Tn1546携带，Tn1546编码9个多肽，这9个多肽同作用赋予细菌对万古霉素的高水平耐药，UDP－胞壁酸五肽的D－丙氨酸－D－丙氨酸上的NH基被D－丙氨酸－D－乳酸的氧所取代，从而取消了肽聚糖前体与抗生素之间原有的一个氢键并使得原来的空间构象发生改变，结果是D－丙氨酸－D－乳酸取代了D－丙氨酸－D－丙氨酸。D－丙氨酸－D－乳酸的产生主要依靠三种酶的作用，VanA连接酶、VanH脱氢酶和VanX二肽酶。VanH脱氢酶催化丙酮酸水解成乳酸，VanX二肽酶破坏D－丙氨酸－D－丙氨酸的连接键，VanA连接酶催化D－丙氨酸－D－乳酸形成。另外VanR基因和VanS基因的产物VanR基因和VanS基因的产物VanR、VanS蛋白与VanA耐药调控有关，在万古霉素的诱导下可激活VanA、VanH和VanX共转录所需的起动子，VanY基因和VanZ基因编码生成辅助蛋白VanY和VanZ。VanY是一种D，D－缩肽酶，可解离肽聚糖前体的D－丙氨酸，但需由VanX共同参与。VanZ可能与肽可霉素低度耐药有关，具体机制不清。

　　在屎肠球菌、粪肠球菌、鸟肠球菌、耐久肠球菌和坚忍肠球菌等也已检出高水平耐糖肽类菌株。实验中发现，这些高耐药菌株可通过接合从粪肠球菌向金黄色葡萄球菌转移。例如发现一株耐万古霉素的鸟链球菌携带与VanB连接酶相关的基因。

　　获得性耐药中的另一表型为VanB型，其耐药菌株主要包括屎肠球菌和粪肠球菌，肠球菌对万古霉素呈不同水平的耐药性，而对肽可霉素敏感。VanB型耐药可以转移，耐药基因存在于质粒或染色体上，转移可能与转座子有关。VanB型耐药株产生39.5kD的蛋白质与VanA有77％氨基酸同源性，编码转座子是Tn1547，包含VanB基因；其耐药机制的生化基础及编码的基因与VanA型相同，细胞壁前体的D－丙氨酸－D－丙氨酸同样被D－丙氨酸－D－乳酸取代，存在VanHB脱氢酶、VanB连接酶和VanXB二肽酶。VanB菌株含辅助基因VanW，其具体作用机制不清，但不包括VanZ基因。此外，有些肠球菌对糖肽类抗生素呈天然耐药，主要表型为VanC型肠球菌，包括鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌和微黄肠球菌，其对万古霉素呈低水平耐药，耐药基因可能存在于染色体上，细胞壁前体由VanC连接酶催化合成D－丙氨酸－D－丝氨酸，使其与万古霉素的亲合力下降。VanC基因又分为VanC1、VanC2和VanC3。临床已有报道金黄色葡萄球菌对万古霉素产生中介耐药，但具体机制还不很清楚。

　　三、细菌的耐药基因检测：

　　（一）耐苯唑西林葡萄球菌基因的检测：如前所述MRS可由mecA介导，也可有高水平的β内酰胺酶或含因修饰致对苯唑西林亲和力降低的PBP。通过基因检测出高水平β内酰胺酶而无mecA基因，即可指导临床医生用药。

　　（二）肺炎链球菌β内酰胺耐药基因的检测：目前编码革兰阴性菌中的TEM、SHV、OXA、CARB和ROB等β内酰胺酶的基因的DNA探针和PCR引物已能合成，故可用基因检测方法检测。医院感染中肺炎克雷伯菌等其他肠杆菌科可产生ESBL和其他能水解头孢噻肟、头孢噻甲羧肟和氨曲南的酶，现在已采用等电聚焦电泳作为鉴定新的β内酰胺酶基因的筛选工具，DNA测序为分析新的β内酰胺基因的“金标准”。

　　（三）氯霉素耐药基因的检测：编码氯霉素乙酰转移酶的基因CATs存在于革兰阴性和阳性菌中，介导氯霉素耐药，检测CAT的探针有catⅠ、catⅡ、catⅢ，但这些探针的特异性尚未肯定。检测革兰阳性厌氧菌如产气荚膜梭菌和艰难梭菌的catP、catQ和catD则具有较强的特异性。

　　（四）糖肽耐药基因的检测：肠球菌耐药性有几种不同的基因，包括vanA、vanB、vanC1、vancC2、vanC3、vanD等，检测上述基因的DNA探针和PCR方法已有报道。日本、美国还报道了对糖肽类抗生素敏感性降低的金黄色葡萄球菌，由于耐药机制不清，目前尚未有相应的基因检测方法。

　　（五）大环内脂、林可霉素和密柑霉素耐药基因的检测：红霉素甲基酶基因（erm）介导耐大环内脂类、林可霉素和密柑霉素为MLS耐药表型；msrA基因仅介导对大环内脂类和密柑霉素耐药为MS耐药表型；mefE为大环内脂类抗生素泵出基因，目前已能用DNA探针和PCR分析法检测上述基因。MsrA基因常见于金黄色葡萄球菌株，其表型耐红霉素，但对氯洁霉素敏感。肺炎链球菌耐红霉素常由mefE基因介导。由于大多数耐红霉素的葡萄球菌菌株同时耐氯霉素，因此当必需选用氯洁霉素治疗时，msrA探针和PCR分析法可判定是存在msrA还是ermA以辅助选药。

　　（六）喹诺酮耐药基因的检测：喹诺酮耐药的两大主要机制为：靶粒改变――细菌的促旋酶（由gyrA和gyrB编码）和拓朴酶（由parC和parE编码）改变；药物主动泵出，限制到达靶粒的药物量。耐药常与gyr和par位点突变相关。目前DNA探针还不能可靠地检测位点的变化，PCR技术扩增后测定gyrA、parC和parE基因的核苷酸序列有助于检测对喹诺酮的耐药性。

　　（七）磺胺耐药性基因的检测：与之相关的耐药基因有sulⅠ和sulⅡ，这两个基因都已克隆、测序，并已有探针合成，但尚未在临床中使用。sulⅠ基因常与可转移DNA元件如Tn21连在一起，它能介导多种耐药基因在细菌间传递。因此sulⅠ基因常可作为革兰阴性菌多重耐药的指针。

　　（八）四环素耐药基因的检测：四环素耐药至少可由15 种不同基因介导，如tet（A）、tet（B）、tec（C）、tet（E）、tet（F）、tet（H）、tet（K）、tet（L）、tet（M）、tet（N）、tet（O）、tet（Q）、和tet（S）。其中tet（M）扩散最广，包括葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌；革兰阴性杆菌如弯曲菌属、阴道加德纳菌、支原体、解脲支原体和淋病奈瑟菌。现已能合成tet（M）、tet（O）和tet（Q）的PCR引物。PCR检测有助于判断牙周疾病用四环素治疗的疗效。

　　（九）三甲氧嘧啶耐药基因的检测：细菌中介导TMP耐药基因（dhfr）数量不断增多，虽然目前尚未找到所有dhfr基因都相同的一致性序列，但是DNA探针仍是检测及分类新甲氧苄啶耐药基因（dhfr）的有力工具。流感嗜血杆菌中现又发现了一新的TMP耐药基因folH。

　　（十）分枝杆菌中耐药性基因的检测：多重耐药结核分枝杆菌的出现，严重地威胁着人类的健康。目前已经能用PCR分析法检测结核分枝杆菌rpoB位点变异，该变异与利福平耐药相关。PCR－SSCP分析能可靠地鉴别利福平敏感株和利福平耐药株。结核分枝杆菌中，利福平耐药也可作为多重耐药的标记。检测麻风分枝杆菌利福平耐药性的PCR引物也已能合成。KatG和inhA基因位点与异烟肼耐药相关，可通过PCR－RFLP分析和PCR产物的DNA序列分析来检测。

　　四、自动化仪器细菌耐药性检测应用：

　　检测细菌耐药机理是当今细菌学的一个最重要的课题，也是正确指导临床医生合理使用抗生素的重要依据。VITEK－2是最新一代的细菌自动快速鉴定及药敏分析系统，围绕临床治疗效果和快速鉴定药敏结果这一重点，高级专家系统确认鉴定和药敏结果的一致性。高级专家系统是目前微生物分析系统向高智能化技术迈进的一大突破，收集了全球超过十万份的权威论著，数据库中含有20000个MIC分布图和2000种耐药表型，专家库里收集了对常见致病菌有治疗作用抗生素的MIC分布图，通过与资料库中的MIC分布图相比较，对细菌生物学进行确认，并确认耐药表型，确定鉴定与药敏结果的一致性，快速准确地分辨细菌的耐药机制，耐药表型和基因型，如PBP改变、ESBL TEM或SHV或PER、氨基糖苷类耐药APH（2’）+AAC（6’）、氨基糖苷类耐药APH（3’）－Ⅲ、ANT（4’）（4’）、四环素类耐药外排（TET K）、靶位改变（TET M），MLSB固有耐药及MLSB诱导耐药等，对耐药趋势发出警告或修改药敏结果，提供临床用药资讯，确保临床疗效。以前微生物实验人员只能看药敏结果给医生提供用药建议，对临床医生提出的问题和不同意见，无法给出令人信服的解释，造成临床与微生物实验室沟通困难；VITEK－2高级专家系统不仅微生物实验人员可不断学习其细菌学知识和抗生素药理知识，更重要的是显著提高药敏检测的质量，提高临床治疗效。

作者：方晓霞 福建省龙岩市第一医院  364000

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