【摘要】 目的：通过观察空肠弯曲菌抗体在正常结肠神经节细胞上的结合，初步探讨空肠弯曲菌抗体影响结肠神经节细胞发育，导致神经节细胞变性的可能性。方法：取正常结肠标本60例，随机分为实验组和对照组，免疫组织化学方法处理。实验组利用空肠弯曲菌抗体作用于正常结肠神经节细胞，观察抗体与神经节细胞的结合情况；对照组利用PBS液代替空肠弯曲菌抗体，其他同实验组。比较两组空肠弯曲菌抗体的结合有无不同。结果：空肠弯曲菌抗体可以和正常结肠的神经节细胞结合，结合的阳性率为83.3%。实验组和对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：空肠弯曲菌抗体可与神经节细胞结合，可能影响神经节细胞发育及导致神经节细胞变性。
【关键词】 弯曲菌•神经节•肠神经元发育异常
肠神经元发育异常（neuronal intestinal malformations，NIM）是小儿外科常见的消化道神经发育畸形，包括先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease，HD）和巨结肠类缘病（allied disorders of Hirschsprung’s disease，ADHD），其基本的病理病因是神经元发育异常导致正常神经节细胞减少或者缺如。而某种或某些细菌、病毒可能是影响肠神经节细胞发育、甚至变性坏死因素［１］。研究表明空肠弯曲菌感染可以导致外周神经系统的损伤如格林-巴利综合征［２-３］。由于空肠弯曲菌容易传染，因而被认为是全世界导致细菌性腹泻的主要原因之一。空肠弯曲菌感染后广泛存在于肠道，能损伤结直肠，存在导致肠神经节细胞损伤的可能。本研究通过检测空肠弯曲菌抗体在正常结肠神经节细胞的结合情况，初步探讨空肠弯曲菌影响神经节细胞发育、甚至变性坏死的可能性。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2005年7月—2006年7月于山东大学第二医院小儿外科行结肠造瘘、肠梗阻、肠代膀胱手术切除结肠的60例患儿临床资料，其中男36例,女24例。年龄4个月~4.5岁,平均年龄（2.33±1.93）岁,所有患儿结肠标本术后病理组织学证实神经节细胞正常。所有标本随机分为实验组、对照组，每组30例。
1.2 免疫组织化学方法 组织标本10%甲醛固定，常规石蜡包埋后进行链酶亲和素-辣根过氧酶免疫组织化学染色，4 μm切片脱蜡至水，实验组加入兔抗人空肠弯曲菌IgG（杭州联科生物技术有限公司）作为一抗，生物素化山羊抗兔IgG（生产厂家）作为二抗。对照组用PBS液代替一抗，其他同实验组。
1.3 结果判定 参考文献［4］的方法并稍做修改。神经节细胞内出现棕黄色颗粒为免疫组织化学阳性细胞，以染色的深浅及阳性细胞数作为观察指标，与背景完全一致的记为1，淡黄色记为2，中等黄色记为3，棕黄色记为4。每张切片在10个高倍镜视野下,分别计数50个细胞，计算阳性细胞的百分比，＜10%记为1， 10%～30%记为2， 30%～50%记为3，>50%记为4。以阳性细胞和染色强度之和的平均数作为定量标准：＜3为阴性表达（-），≥3为阳性表达（+），所有切片结果由病理学专家判定。
1.4 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件包进行分析，所得数据进行四格表资料的χ2检验。P≤0.05为差异有显著性意义。
2 结果
实验组正常结肠的神经节细胞内可见空肠弯曲菌抗体与神经节细胞结合的棕色颗粒,其阳性率为83.3%；而对照组没有发现空肠弯曲菌抗体结合的棕色颗粒,其阳性率仅为10%,实验组与对照组比较差异有统计学意义（χ2＝30.19，P＜0.01，图1，表1）。
3 讨论
肠神经元发育异常是导致小儿顽固性便秘甚至肠梗阻的重要原因，其病因一直是人们争论的热点。现在一般认为肠神经元发育异常是由遗传因素和环境因素（如毒素、炎症、缺血缺氧等）多种原因导致的一种疾病，常常并发结肠炎症［5］。研究发现细菌感染可能是导致此类疾病并发小肠结肠炎的重要原因［6］。而致病细菌的具体种类及与肠神经系统损伤的因果关联，目前并没有深入研究。
空肠弯曲菌为革兰阴性微需氧弯曲菌，被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因之一,在世界各地和各个年龄组均有日益增长的趋势。空肠弯曲菌感染的发病率呈双峰型，以婴幼儿和15～29岁年龄组最高，在发展中国家多集中在5岁以下（尤其是1岁以内）的儿童，我国最近的调查表明2岁以下小儿腹泻空肠弯曲菌检出率最高［3］。对空肠弯曲菌的致病机制的研究认为其致病因素包括黏附、侵袭、产生毒素和分子模拟机制等4个方面［7］。Schwerer等［8］研究表明空肠弯曲菌感染可以通过分子模拟机制引起外周神经组织的损伤。动物实验证明，空肠弯曲菌体成分脂多糖核心低聚糖与神经组织成分神经节苷脂有相似的抗原性,当空肠弯曲菌感染机体后, 刺激机体免疫系统产生相应的空肠弯曲菌特异性抗体, 由于存在交叉反应,该抗体不仅与空肠弯曲菌体结合,同时也与神经组织成份神经节苷脂结合,引起局部神经病理损伤［9］。神经节苷脂是维持神经元存活、生长、分化和功能所必需的神经营养物质。在正常发育过程中，神经节苷脂可能参与神经元的生长、分化和表型的表达，以及细胞的迁移和神经生长锥的定向延伸。若神经节苷脂功能失活，会导致细胞黏附分子与细胞膜的结合力下降，从而影响迁移 ,导致神经元的发育异常［10］。神经系统发育成熟以后，神经节苷脂对其具有一定的保护、修复作用。
目前对于空肠弯曲菌导致外周神经系统损伤的研究比较多，主要局限在格林-巴利综合征上，对于空肠弯曲菌对肠道神经系统有无损伤作用，通过什么机制导致肠道神经系统损伤，并没有深入的研究。本研究结果显示空肠弯曲菌抗体在正常结肠神经节细胞上的阳性表达率为83.3％，说明空肠弯曲菌抗体可以与肠道正常神经节细胞结合，有导致神经节细胞变性的可能。因而初步认为：在肠道神经系统发育过程中，由于空肠弯曲菌存在的广泛，并且容易传播感染，导致患儿感染空肠弯曲菌；由于空肠弯曲菌肠炎在婴幼儿时期症状多不明显，导致大部分患儿病情被忽视，仅部分患儿产生小肠结肠炎表现。空肠弯曲菌感染后，可能通过抗体的分子模拟机制，与神经元的神经节苷脂结合，影响神经元生长、分化、存活，从而阻碍肠道神经节细胞的发育成熟，导致肠道功能障碍的发生。而对于肠道神经系统发育成熟的患儿，空肠弯曲菌可以通过分子模拟机制，破坏对神经元起保护作用的神经节苷脂，使神经节细胞更容易受到毒性产物的损害，导致神经节细胞变性甚至坏死。但是仅通过本研究，并不能充分说明空肠弯曲菌的抗体一定可以导致神经节细胞变性，需要通过进一步的临床研究，来明确空肠弯曲菌抗体对肠道神经节细胞的作用。
作者：韩克 李金良 李殿国 孙小兵 张丽 宋磊
【参考文献】
[1] 齐林，郜向阳，靳三丁，等.新生儿先天性巨结肠合并小肠结肠炎的临床治疗及高危因素[J].临床小儿外科杂志，2006，5（1）：8-9.
[2] Attarian S, Bonnefoi-Kyriacou B, Gayraud D, et al. Guillain-Barre syndrome of axonal type, Campylobacter jejuni infection and anti-ganglioseside GM1 antibodies[J]. Rev Neurol （Paris）, 1997,153（3）:205-208.
[3] Kaida K, Kusunoki S, Kamakura K, et al. Guillain-Barre syndrome with antibody to a ganglioseside, N-acetylgalactosaminyl GD1a[J]. Brain, 2000,123（Pt 1）:116-124.
[4] Mattern J, Koomagi R, Volm M. Association of vascular endothelial growth factor
expression with intratumoral microvessel density and tumour cell proliferation
in human epidermoid lung carcinoma[J]. Br J Cancer 1996; 73: 931-934.
[5] 戴康临，陶强.先天性巨结肠症的病因学研究进展[J].临床小儿外杂志,2005,4（3）:200-201.
[6] 陈志新，吕德生，万绍平，等.儿童空肠弯曲菌感染的流行病学研究[J].中华预防医学杂志，1995，29（3）：144-146.
[7] John E. MOORE, Deborah CORCORAN, James, et al. Campylobacter[J]. EDP Sciences, 2005,36（2005）:351-382.
[8] Schwerer B, Kitz HL, Bernheimer. Ganlioseside GMI,a molecular target for
immunological and toxic attacks：similarity of neuropathological lesions induced by ganglioseside-antiserum andcholera toxin[J]．Acta Neuropatho1,1986,72（1）:55-61．
[9] Kaida K, Kusunoki S, Kamakura K, et al. Guillain-Barre syndrome with antibody to a ganglioseside, N-acetylgalactosaminyl GD1a[J]. Brain, 2000,123（Pt 1）:116-124.
[10] 谢龙山,蔡方成,高玉兴,等.空肠弯曲菌毒素对周围神经的损伤作用研究[J].中华儿科杂志,2003,41（12）：934-939.
