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艰难梭菌细胞毒素B功能区的表达



录入时间:2010-12-20 14:27:31 来源:中国论文下载中心

 1材料和方法
  1.1材料限制性核酸内切酶,T4DNAligase购自New  England Biolab公司. 厌氧发生剂、脑心浸液(干粉)购自生物梅里埃公司(bioMerieux). 其他试剂为国产分析纯. 艰难梭菌(clostridium difficile, C.d VPI10463)从兰州生物制品研究所购买. 大肠杆菌菌株BL21(DE3)及质粒PET22b(+)系南方医科大学消化研究所存. 
  1.2方法
  1.2.1目的基因的获得C.d VPI 10463接种于脑心浸液(BHI)培养基中,37℃厌氧环境中透析培养72 h. 碱裂解法提取C.d基因组DNA. 参考Gene bank收录的C.d VPI 10463基因序列,设计引物如:sense:   5′TCCGAATTCG CTTATGTCAACTAGTGAA3′ EcoRI,  antisense: 5′GCACTCGAGTTCACTAATCACTAATTG3′, XhoI.  反应条件:50 μL反应体系,热启动法,94℃变性45   s, 60℃退火60 s, 72℃延伸150 s, 39个循环后再延伸10 min. 10 g/L糖凝胶电泳观察扩增结果. 
  1.2.2重组质粒的构建与鉴定将酶切、纯化的目的基因、质粒PET22b(+)按10∶1(摩尔数) 在T4DNAligase作用下16℃连接12 h. 热休克法转化. 挑单个菌落,接种在选择性LB液体培养基中,A600 nm值达0.6,提取重组质粒. 重组质粒的鉴定:用EcoRI与XhoI双酶切鉴定;以重组质粒为模板,进行PCR反应,送上海博亚公司测序. 
  1.2.3目的基因表达阳性克隆菌落接种到2 mL选择性LB培养液37℃, 180 r摇菌致A600 nm为0.6,4℃过夜,然后2%转接LB培养液中,培养3 h至A600 nm值为0.8,加IPTG至终浓度为1 mmol/L,诱导后取样. 产物进行SDSPAGE分析.
  2结果
  2.1PCR扩增的目的基因电泳分析发现在1800 bp左右有一条带,大小与预计相符(图1). 
  图1琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物  略
  2.2重组质粒的鉴定将获得重组质粒命名为PET22b(+)CDB3,电泳初步鉴定结果与预期相符(图2). 直接以PET22b(+)CDB3为模板进行测序,得到的DNA序列,与Gene bank记录的C.d VPI10463的ToxinB3基因序列的同源性为99%. 
图2目的基因的PCR产物、重组质粒和PET22b(+)载体用EcoRI单酶切的图谱 略
  2.3重组蛋白的诱导表达经IPTG诱导后,120 g/L SDS PAGE分析表明,含有PET22b(+)CDB3宿主菌表达出Mr约为71.3×103,与预期的蛋白大小相符,含质粒pET 22b(+)及无质粒的细菌则无此特异条带. 在A600 nm值为0.8,IPTG终浓度为1 mmol/L,诱导4 h时,重组蛋白的表达量最大,以可溶性蛋白为主,便于纯化. 凝胶自动扫描分析,其PET22b(+)CDB3重组蛋白占细菌周质总蛋白的34%,可溶性表达占上清的22.7%,包涵体占沉淀的25.7% (图3). 
  图3CDB3基因诱导表达产物的SDSPAGE分析 略
  3讨论
C.d是肠道感染中仅次于弯曲杆菌的常见致病菌,产生的毒素A与毒素B对人体造成危害,被公认为发达国家中最重要的院内感染源之一[1]. 虽然口服甲硝唑或万古霉素治疗可取得较好的疗效,但目前已存在耐药及停药后复发等问题. 疫苗接种可使高危人群获得持久和较强的免疫力,是预防与控制感染的有效措施[2]. C.d重组抗原的研究已见较多的报道,但多数是集中在毒素A上[3],而对毒素B的研究则相对较少. Genth等[4]的研究将毒素B分成3个氨基酸片段:CDB1(氨基酸1546),CDB2(氨基酸 9011750),CDB3(氨基酸17512366),发现抗毒素B抗体与CDB3可以发生强烈反应,抗C.d抗体既与CDB1又能与CDB3 反应,CDB2则与两抗体均不反应. 说明CDB3是良好的抗原. 进一步实验发现,只有抗CDB3抗体才能保护完整细胞免受毒素B的细胞毒性,而抗CDB1抗体只有进入细胞内才能起保护作用 . 说明该段很有可能成为制备疫苗和诊断抗原的重要候选蛋白. 故选取了毒素B羧基末端CDB3 (氨基酸17512366)进行表达,为以后的疫苗和抗原鉴定的研究建立基础. 
     
  本研究参考C.d国际标准株VPI 10463基因序列,用自行设计的CDB3引物在PCR反应中表现出较高的特异性,为理想的引物序列. 在上、下游引物中分别加入EcoRI与XhoI酶切位点,保证了读码方向的正确性. 为便于下一步的表达和纯化工作又将其装入了末端带有His标签的融合表达载体,酶切鉴定和测序结果显示获得了带有特异的CDB3基因. 蛋白电泳分析表明获得了高效表达的C.d ToxinB3克隆株,本实验所表达的蛋白,与该基因编码的蛋白的分子质量大小是一致的,更进一步验证了克隆的目的基因的正确性. 因此,本研究为研制C.d重组疫苗及制备诊断试剂 奠定了一定的基础.

作者:刘红升,张清华,姜泊,蒋知新《中国生物制品学杂志》
 

 【参考文献】 (略)
 

 

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