【摘要】  目的 探讨老年人龋坏组织中变形链球菌（MS）和乳酸杆菌（LB）在致龋过程中的特点。方法 136例龋坏组织样本按患者年龄、患牙龋坏程度和龋坏活跃性分组，利用选择性培养基对MS及LB行分离、培养和鉴定。统计两种细菌在不同组别中细菌菌落形成单位（CFU）计数及两种细菌致龋样本例数。结果 在老年龋组、严重龋组（中、深龋）和活动期龋组中，MS与LB的CFU计数均显著升高(均P＜0.05)；MS与LB共同致龋样本数在老年龋组中显著升高(P＜0.05)，并随龋坏程度的加重而升高(P＜0.05)。结论 在老年龋病及中、深龋中，MS与LB为互生关系，有明显共同致龋作用。 
【关键词】  变形链球菌；乳酸杆菌；老年人；龋坏组织
变形链球菌（MS）和乳酸杆菌（LB）与龋病的形成和发展密切相关。MS是口腔主要致龋菌，对其在细菌毒力、致龋机制方面已有研究〔1〕，而有关LB的致龋作用颇有争议，有学者认为LB是龋坏的结果而不是龋坏的原因〔2〕；另有研究认为在致龋初期LB并不致龋，而在龋坏进入深层时，LB由于其较强的耐酸性而大量繁殖并产酸，协同MS致龋〔3〕；有人指出LB有可能因抑制龋病病原菌的繁殖而抑制龋病的发展〔4～5〕。本研究通过分离、培养及鉴定136例龋坏组织样本中的MS和LB，探讨MS与LB的致龋特点及老年龋病患者龋坏组织中的菌与龋病严重程度的关系。
    1  材料与方法
    1.1  细菌培养基与鉴定方法  细菌培养基采用改良轻唾琼脂培养基(MS)〔6〕与Rogasa培养基(LB)〔7〕，分别采用Dentocult SM 法和Dentocult LB法鉴别MS和LB致龋活跃性。
    1.2  方法
    1.2.1  采样及样本分组  龋坏组织样本，由同一操作者于2006年11月～2007年3月在本院、甘肃省第二人民医院及兰州军区总医院口腔科的90位患者（136颗患牙）采集，每患牙采集1例样本，共取样本136例。研究对象无系统疾病，采样前2 w内未使用任何抗生素药物，并知情同意。准备盛有1.0 ml灭菌生理盐水1.5 ml离心管及1＃挖器（Q/ILLS0022001），常规无菌操作采样。采样过程如下：先将挖器前端置酒精灯外焰烧灼灭菌（3次，6～7 s/次），将取样部位进行冲洗、隔湿、干燥，然后刮取龋坏组织至平1＃挖器勺部。将所取样本浸入离心管液体中，轻摇、混匀。将离心管标号，2 h内送检。所剩样本加300  μl 80%甘油，冻存备用（-20℃）。将样本按照年龄分为老年组（年龄≥60岁）、恒牙组（年龄12～59岁）和乳和替牙组（年龄≤13岁）；按龋坏程度分为浅龋、中龋和深龋组；按龋病活跃性分为活动期组和静止期组。
    1.2.2  细菌接种及孵化  将样本混匀后，分别取20 μl接种于两种培养皿，20%O2、80%CO2、37℃恒温条件下培养48 h。
    1.2.3  细菌形态学及专用培养基鉴定  MS菌落为透明、边缘略整齐、中心微隆起似雨滴状菌落；LB菌落乳白色、边缘略不整齐、中心微隆起菌落。随机法，将本实验分离获得的两种细菌分别二次克隆后接种于Dentocult SM与Dentocult LB上培养，生长良好,证明本实验培养两种菌为目的菌。
    1.2.4  菌落计数  136例样本中，共120例检出MS和(或)LB，对两种培养皿中菌落行盲法计数(每皿计数3次，最后取均数)。本实验设定：如MS的CFU计数对数值≥MS的CFU计数对数值的单侧90%下限值〔P10(MS)〕，且LB的CFU计数对数值＜LB的CFU计数对数值的单侧90%下限值〔P10(LB)〕，则该样本所对应病例中MS为主要致龋细菌；如MS的CFU计数对数值＜P10(MS)，且LB的CFU计数对数值≥P10(LB)，则该样本所对应病例中LB为主要致龋细菌；如MS的CFU计数对数值≥P10(MS)，且LB的CFU计数对数值≥P10(LB)，则该样本所对应病例中MS与LB共同致龋。如MS的CFU计数对数值＜P10(MS)，且LB的CFU计数对数值＜P10(LB)，则该样本不进入细菌相关致龋病例数统计。
    1.3  统计学处理  MS和LB的CFU计数因频数分布呈偏态分布，经对数转换后呈正态分布(区间宽度0.25)，其组间比较采用方差分析。利用公式 1.282 s计算P10(MS)和 P10(LB)。计数资料组间比较采用χ2检验。
    2  结  果
    2.1  MS和LB的CFU计数对数值  MS的CFU计数对数值为4.571 2±0.722 8；LB的CFU计数对数值为4.475 6±0.741 9。计算P10(MS)为3.644，P10(LB) 为3.524。在本实验中有10例MS的CFU计数对数值＜P10(MS)，且LB的CFU计数对数值＜P10(LB)，因而不同细菌相关致龋病例数为110。
    2.2  不同组别中CFU计数均数对数值比较  各年龄组别中，老年组两种细菌CFU计数均数对数值均升高(P＜0.05)（表1）；不同龋坏程度组中，MS与LB的CFU计数均数对数值分别随着龋坏程度加重而升高(P＜0.05)（表2）；不同龋病活跃性组中，活动期组两种细菌CFU计数均数对数值均升高(P＜0.05)（表3）。
    2.3  与不同细菌相关龋坏病例数比较  老年组两种细菌共同致龋病例数均升高(χ2=12.328 5，P＜0.05)（表1）；两种细菌共同致龋病例数随着龋坏程度的加重而升高（χ2＝10.170，P＜0.05)（表2）；活动期组与静止期组两种细菌共同致龋病例数差别无统计学意义（χ2= 2.298，P＞0.05）（表3）。表1  不同年龄分组中MS及LB的CFU均数对数值表2  不同龋坏程度分组中MS及LB的CFU均数表3  龋病活跃性分组中MS及LB的CFU均数
3  讨  论
    龋病在临床上具有明显的年龄特征。第三次全国口腔健康流行病学调查结果显示：我国5岁儿童乳牙龋病患病率为66％、65～74岁的老年人龋齿患病率高达98％。这除了与不同年龄对口腔卫生的重视程度、饮食习惯不同外，还与口腔组织的增龄变化有关。周学东等 〔8〕发现老年人釉质与青少年釉质对龋损形成的敏感性没有明显的差异，提示因年龄增长导致的牙体硬组织成分、结构变化并不能完全解释龋病的成因。本研究发现在老年组龋坏组织中，两种细菌共同致龋作用增强明显（P＜0.05），说明老年组龋坏组MS和LB是互生关系，即致龋过程中，两种微生物间相互受益。这可能与老年人的唾液腺增龄性萎缩，唾液的流速和缓冲能力均降低有关。
    细菌的致龋能力主要是因为能黏附至牙面并发酵蔗糖产酸和耐酸。MS最适生长pH值为6.5，而LB最适pH值较低，在5.5～6.2之间，两者都能在pH值很低，甚至在pH值3.5的环境中生长。MS对牙面有蔗糖非依赖性黏附和蔗糖依赖性黏附两种黏附机制，其中，蔗糖依赖性黏附可高度促进MS在牙面的黏附和聚集〔9〕。凭借这种黏附机制，MS附着于光滑牙面的致龋作用较强〔10〕。有学者发现LB对Ⅰ型胶原蛋白具有强亲和力；当龋洞形成以后，由于局部微生态的差异、唾液的冲洗和缓冲能力减弱、缺乏磷灰石的缓冲等原因，更为LB提供了适宜的条件，因此，随着龋坏程度的严重，LB参与了成龋的过程。理论上，这两种菌间存在协同或竞争和拮抗等关系〔11〕。本研究结果显示，浅龋中MS与LB的共同致龋作用并不明显，但随着龋坏程度的增加，二者的致龋过程有可能存在协同作用。
    本研究结果显示，龋病处于活动期时，MS和LB的CFU计数均数均明显升高，龋病处于静止期时，MS和LB的CFU计数均数均明显降低(P＜0.05)。当龋病处于活动期时，四联因素充分发挥作用，有利于两种细菌的繁殖，细菌的繁殖在数量上明显增多，而静止龋因龋损外露或开放，原有致病条件发生了变化，不利于两种细菌的繁殖，细菌总数也随之减少。对于两种细菌共同致龋病例数与龋病的活动期或静止期无关这一现象，以及LB在龋病的形成和发展过程中的致龋机制有待进一步的研究。
综上所述， LB与MS的共同致龋作用随着龋坏程度的增加而增加，且在老年龋病中作用明显。这一结果为龋病尤其老年龋病的生物学诊断、预防、治疗提供了新的思路。
作者：周建业 张金婷 肖云 车团结 何祥一 《中国老年学会杂志》
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