摘要:目的 探讨肠球菌溶血素与毒力的关系。方法  比较溶血性肠球菌在临床标本及健康人群粪便标本的检出率;比较溶血性、非溶血性肠球菌对小鼠的LD50及其对9种抗生素的敏感性。结果 临床标本肠球菌的溶血素检出率61.5%,高于健康人群粪便标本(18.4%,P<0.05);溶血性肠球菌的LD50[(3.9~11)×108cfu/mL]比非溶血性肠球菌小[(2.5~8.9)×10¹⁰cfu/mL,P<0.01]。除丁胺卡那、万古霉素外，溶血性肠球菌对抗生素的耐药性明显高于非溶血株。结论  肠球菌的溶血素可能与其毒力有关。

　　关键词:肠球菌属; 溶血素类; 毒力; 药物耐受性

　　　ABSTRACT: Objective To investigate the relation between enterococcus hemolysin and its virulence.

 Methods：Incidence of hemolysin of enterococci derived from clinical isolates and healthy people fecal specimens were examined respectively; LD50 and antibiotic susceptibilities were compared between hemolytic strains and non hemolytic strains. Results　Strains derived from clinical isolates exhibited higher(61.5%) incidence of hemolysin than that from healthy people fecal speciments(18.4%, P<0.05). The LD50 of hemolytic strains [(3.9~11) 108cfu/mL] were at least 10fold higher than those of nonhemolytic strains[(2.5~8.9) 1010cfu/mL], P<0.01. Hemolytic strains were found to be more resistant to all the 9 antibiotics tested, except amikacin and vancomycin. Conclusion These results implied that hemolysin may contribute to the virulence of enterococci.

　　KEY WORDS: enterococcus; hemolysins; virulence; drug tolerance

　　肠球菌已成为院内感染的第二位主要原因[13],其致病因子的研究十分迫切与重要。有研究表明,肠球菌溶血素在眼内炎、心内膜炎、腹膜炎等动物模型中有致病作用[46]。笔者比较溶血性肠球菌、非溶血性肠球菌对小鼠的LD50及其对抗生素的敏感性,通过医院临床标本以及健康人群粪便标本肠球菌溶血素的检出率调查,探讨溶血性、非溶血性肠球菌的毒力差异以及溶血素在肠球菌的毒力作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株

　　1.1.1.1 肠球菌菌株      

　　临床菌株分离自福建医科大学附属协和医院及福建省立医院就诊患者的尿液、胆汁、腹腔液和心瓣膜、白带、前列腺等临床标本,健康人群菌株分离自某宿舍区健康自愿者、福建医科大学教职工、学生等粪便标本。

　　1.1.1.2 质控菌株       

　　药敏质控菌:肠球菌ATCC29212(敏感株)、肠球菌ATCC51299(耐药株)、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922(卫生部药品生物制品检定所)。溶血对照乙型链球菌Bd1、甲型链球菌Bc3为福建医科大学病原生物学系保存菌株。

　　1.1.2 动物 

　　出生4周昆明种小鼠,体质量(19±1)g,雄性,清洁级(闽实动质准第00205),福建医科大学实验动物中心提供。

　　1.1.3  培养基

　　1.1.3.1  肠球菌培养基ELB1       

LB培养基(1％胰蛋白胨,0.5％酵母提取物,1％NaCl)添加0.4%Na2HPO4,0.2%葡萄糖,0.8%枸橼酸钠,pH 7.6~7.8。

1.1.3.2 粪便分离肠球菌选择培养基ELB2ELB1培养基添加5%NaCl,0.05%结晶紫,20 U/mL卡那霉素,pH 7.6~7.8。

　　1.1.4 cylA引物       

　　扩增片段范围544~1024 bp(日本Takara公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肠球菌鉴定

　　参照文献[7]方法。

　　1.2.2 肠球菌溶血素检测       

　　表型测定:待测菌接种于ELB1肉汤,37 ℃培养过夜,将培养液划线分离接种到5%兔血平板,37 ℃培养36 h,出现透明β溶血环为溶血表型阳性,并用甲型链球菌Bc3、乙型链球菌Bd1做а、β溶血对照。基因型测定:以cylA引物扩增544~1024 bp的cylA片段,PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色,480 bp位置出现相应条带为基因型阳性。表型及基因型均阳性为溶血性肠球菌,表型及基因型均阴性为非溶血性肠球菌。
               
　　PCR反应体系(μL):ExTaq预混液12.5;上游引物F 1.0;下游引物R 1.0;菌液上清1.0;高压灭菌水9.5;总计25.0。PCR反应程序:94 ℃ 3 min→(94 ℃ 30 s→56 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s)×30→72 ℃ 7 min。

　　1.2.3  LD50测定       

　　选取溶血性、非溶血性肠球菌各8株,分别接种于ELB肉汤,37 ℃培养48 h,取培养物5000 r/min离心5 min,PBS洗3次,用无菌生理盐水调节浓度至1×1011,1×1010,1×109, 1×108和1×107cfu/mL 5个稀释度。腹腔注射小鼠,每种浓度5只,每只0.5 mL。连续观察7 d,记录死亡情况。Karber法计算LD50[8]。

　　1.2.4  抗生素药敏实验       

　　美国临床实验室标准化委员会推荐的常规药物纸片扩散法,并用质控菌为对照。

　　1.3 统计学处理       

　　临床标本、健康人群粪便标本的肠球菌溶血素检出率的比较、溶血性肠球菌、非溶血性肠球菌的耐药性分析均采用χ2检验,溶血性肠球菌、非溶血性肠球菌对小鼠的LD50分析采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 肠球菌溶血素的检出率       

　　对90株临床标本、40株健康人标本的肠球菌同时进行溶血素表型及基因型的检测(PCR扩增544~1024 bp的cylA片段,图1),对其中表型与基因型相符合的116株肠球菌进行溶血素检出率统计,结果见表1(χ2=11.17,P<0.05)。表1 临床及健康人标本来源的肠球菌溶血素检出率（略）

　　2.2 溶血性、非溶血性肠球菌对小鼠的LD50      

　　8株溶血性肠球菌的LD50(3.9~11)×108cfu/mL,8株非溶血性肠球菌中6株LD50(2.5~8.9)×1010cfu/mL,2株>10×1010 cfu/mL。非溶血性肠球菌的LD50比溶血性肠球菌至少高10倍(P<0.01),溶血性肠球菌的毒力比非溶血性肠球菌强。

　　2.3 溶血性、非溶血性肠球菌对抗生素的敏感性       

　　纸片法检测44株溶血性、40株非溶血性肠球菌对9种抗生素的敏感性。除丁胺卡那、万古霉素外,溶血性肠球菌对其他几种抗生素的耐药性均高于非溶血性肠球菌,经χ2检验,差别有统计学意义(表2)。表2溶血性肠球菌、非溶血性肠球菌对抗生素的耐药率（略）

　　3 讨 论

　　3.1　肠球菌溶血素的检测       

肠球菌溶血素表型的检测可因红细胞来源、红细胞新鲜度、红细胞浓度、血平板厚度以及培养时间等因素的影响,结果差异较大,α、β溶血有时并不好区分。为提高溶血素检出的准确性,笔者同时检测肠球菌溶血素基因。肠球菌溶血素基因大约7 kb,由cylA、B、L、M、I、R等组分组成。其中cylA片段高度保守,因此选用该基因片段进行PCR检测诊断,发现部分携带cylA基因的肠球菌并未出现相应的β溶血素表型,提示致病基因可能在某些条件下处于沉默状态。Eaton等认为这可能是由于基因操纵子部分缺失,或者致病基因只在体内环境表达[910]。笔者对肠球菌溶血素同时进行表型及基因型检测,对二者相符的菌株进行溶血素检出率统计,提高肠球菌溶血素检出的准确性。

3.2 溶血性、非溶血性肠球菌的毒力差异       

　　实验结果表明,临床标本中肠球菌溶血素的检出率高于健康人群粪便标本,说明肠球菌溶血素在临床感染中起一定作用,具备毒力因子的特征。进一步比较溶血性肠球菌与非溶血性肠球菌对小鼠的LD50,由于肠球菌是正常菌群,毒力较弱,LD50值较高,但是二者对小鼠LD50有差别,所有溶血性肠球菌的LD50比非溶血性肠球菌至少低10倍,说明溶血素在肠球菌中具有毒力作用。实验结果表明溶血性菌对抗生素的耐药率高于非溶血性菌,这也从一定程度体现了肠球菌溶血素的毒力作用。因为毒力株(溶血株)常在抗生素的治疗环境中,承受更大的抗生素选择压力,导致耐药率更高。也有人认为肠球菌的溶血素对细胞壁的降解作用可使抑制细胞壁生长的抗菌素失去作用,引起耐药[11]。

　　3.3 肠球菌的毒力与耐药性       

溶血性菌株、非溶血性菌株对丁胺卡那霉素、万古霉素耐药率没有明显差别,可能原因:(1)有些肠球菌对磺胺、卡那霉素等抗生素呈现固有耐药;(2)目前福州地区肠球菌菌株对万古霉素耐药率还较低,导致统计学处理无显著性。
               
　　本研究中肠球菌溶血性菌株的耐药性比非溶血性溶血菌株严重,这一现象提示肠球菌致病性与耐药性之间或许还存在某些联系。肠球菌的溶血素及药物抗性可由质粒、转座子等所编码,因此一些编码溶血素或药物抗性的基因可因接合、转座等相互播散或连锁,加剧了肠球菌的致病性与耐药性,给防治带来困难,对此应予以关注。

作者：强华, 谢曼凌《福建医科大学学报》

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