【摘要】  目的：建立一种简便、实用的酵母菌药敏试验方法。方法：酵母菌纸片扩散法。结果：38株真菌在M44P方案平皿和M27A方案平皿上对氟康唑的平均抑菌圈直径分别为31.32 mm和31.26 mm，t=0.16，P=0.874>0.05；38株真菌在M44P方案平皿和M27A方案平皿上对沃尔康唑的平均抑菌圈直径分别为33.50 mm和33.24 mm，t=1.15，P=0.257>0.05。结论：M44P酵母菌纸片扩散法敏感试验方案操作简便、实验结果稳定、可靠。

【关键词】  酵母菌药敏试验方法 酵母菌纸片扩散法 比较

    随着各种抗真菌药物的相继问世和耐药真菌菌株的出现，真菌药物敏感性试验已越来越受到人们的重视，为此美国临床试验室标准化委员会（NCCLS）于2003年介绍了M44P酵母菌纸片扩散法敏感试验方案，制定了氟康唑（floconazole）和沃尔康唑（voriconazole）质控株的参考范围及氟康唑的抑菌圈解释标准，研究已证实氟康唑对酵母菌的纸片扩散法敏感试验有很好的重复性，可方便、准确地检测酵母菌对氟康唑的敏感性［1～5］。我科同时用M44P方案和M27A方案酵母菌纸片扩散法敏感试验两种方法对36株临床常见酵母菌及2株质控株进行氟康唑和沃尔康唑纸片扩散法敏感试验进行比较。

　　1.1  试验菌株 

　　36株临床常见酵母菌来源于临床各科送检的痰液、尿液及阴道拭子等标本，用SDA（沙保弱培养基）分离培养，先经科玛嘉显色培养基初步鉴定，后经API 20C准确鉴定，其中有白色假丝酵母菌19株，热带假丝酵母菌5株，光滑假丝酵母菌4株，克柔假丝酵母菌3株，近平滑假丝酵母菌3株，季也蒙假丝酵母菌2株；质控菌株：白色假丝酵母菌ATCC90028 1株和近平滑假丝酵母菌ATCC22019 1株均为北京协和医院细菌室老师惠赠。

　　1.2  设备 

　　(35±1)℃孵育箱，0.5号麦氏标准比浊管（自配方法：取0.5 ml 0.048 mol/L BaCl2(1.175%W/VBaCl2·2H2O)加入99.5 ml 0.18 mol/ H2SO4溶液中即可获得0.5号麦氏标准比浊管。

　　1.3  药敏纸片 

　　氟康唑25 μg/片，沃尔康唑1 μg/片。

　　1.4  M44P方案酵母菌药敏培养基 

　　此培养基是在普通细菌药敏试验所用的MH琼脂基础上，经补充2%的葡萄糖和0.5 μg/ml的美蓝改良而成。具体制法：500 ml MH琼脂中加入50 ul美蓝（Methylene blue）贮存液（0.1 g美蓝加入20 ml无菌蒸馏水即为美蓝贮存液）和10 g葡萄糖，调节pH至7.0，121℃，15 min高压灭菌，出锅后在56℃水浴数分钟，在直径为90 mm的平皿中倒入25 ml，使培养基厚度约为4 mm。

　　1.5  M27A方案酵母菌药敏培养基 

　　RPMI1640+2%葡萄糖+MOPS+2%Bacto琼脂。具体制法：将Bacto琼脂20 g、MOPS 40 g、葡萄糖20 g溶于900 ml蒸馏水中，调节pH至7.0，115℃高压15 min，出锅后冷却到45℃时加入RPMI1640一袋，混匀即可倾注平皿，在直径为90 mm的平皿中倒入25 ml，使培养基厚度约为4 mm。

　　1.6  方法

　　1.6.1  制备浊度为0.5麦氏管浊度的酵母菌悬液 

　　用接种环挑取数个酵母菌菌落到2 ml的无菌生理盐水中使酵母菌悬液的浊度为0.5麦氏管浊度，使酵母菌的菌量约为（1～5）106个/ml。

　　1.6.2  接种药敏平皿 

用上述制备好的酵母菌悬液浸湿无菌棉签后，让棉签在试管壁上轻轻挤压，挤掉多余的酵母菌悬液，用棉签的侧面而不是顶端从三个不同角度密涂平皿，每个角度相差约60°，最后沿平皿内缘涂沫一周，每株酵母菌接种M44P和M27A方案酵母菌药敏培养基各一块，在涂布细菌的过程中应避免划破平皿上的琼脂，以免影响观察实验结果。

1.6.3  贴药敏纸片 

　　把接种好酵母菌悬液的药敏平皿放入35℃的孵箱放置约10 min（目的是让琼脂充分吸收酵母菌悬液，避免此液体稀释纸片上的药物，导致纸片上药物的扩散速度与酵母菌的生长速度的不协调性），取出后，在每块平皿上贴氟康唑（floconazole）（25 μg/片）和沃尔康唑（voriconazole）（1 μg/片）各一片，使纸片距离平皿边缘在15 mm以上，两纸片间距在30 mm以上，轻轻压实，切勿让药敏纸片脱落。

　　1.6.4  孵育 

　　让平皿底朝上盖朝下，35℃孵育18 h～24 h后判读药敏试验结果，如果真24 h生长不足，就延长到48 h再判读试验结果。

　　1.6.5  判读结果 

　　以80%抑制区判读为测量边界，在抑菌圈边缘或内部<20%的少量菌落可忽略不计，测量抑菌圈直径要准确到毫米；NCCLS规定的氟康唑和沃尔康唑对标准菌株抑菌圈直径（mm）的质控允许范围见表1，NCCLS规定的氟康唑纸片扩散法解释标准和相应的最小抑菌浓度见表2，但是需要特别指出的是:到目前为止，NCCLS还没有建立沃尔康唑纸片法的解释标准。表1  氟康唑和沃尔康唑对不同标准菌株24 h抑菌圈直径（略）表2  氟康唑纸片扩散法解释标准和相应的最小抑菌浓度（略）

　　1.7  质量控制 

　　试验时，以白色假丝酵母菌ATCC90028和近平滑假丝酵母菌ATCC22019为对照同时进行，其24 h抑菌圈直径（mm）在规定的允许范围之内。

　　1.8  数据分析 

　　采用John Steeling创建的WHO NET5和SPSS 11.5处理。

    我科的检测结果见表3。表3  我科检测的2株质控酵母菌及36株临床酵母菌在两种平皿上的结果(略)

    2株标准质控菌株在M44P方案和M27A方案的两种平皿上对氟康唑和沃尔康唑24 h抑菌圈直径（mm）在质控允许的范围之内。38株真菌在M44P方案平皿和M27A方案平皿上对氟康唑的平均抑菌圈直径（mm）分别为31.32 mm和31.26 mm，经配对t检验，t=0.16，P=0.874>0.05,说明氟康唑在M44P方案平皿和M27A方案平皿上的药敏试验结果无明显差异；38株真菌在M44P方案平皿和M27A方案平皿上对沃尔康唑的平均抑菌圈直径（mm）分别为33.50 mm和33.24 mm，经配对t检验，t=1.15，P=0.257>0.05,说明沃尔康唑在M44P方案平皿和M27A方案平皿上的药敏试验结果无明显差异。

    近年来，真菌病发病率呈明显上升趋势，特别是条件致病性真菌感染更为常见，这与临床上滥用抗生素、经常应用激素及免疫抑制剂、抗癌药物导致机体免疫功能下降有关，加之真菌对抗真菌药物耐药性日益加重，因而加强对临床分离出的酵母菌进行药敏试验已迫在眉睫。目前，真菌药敏试验方法不多，主要有NCCLS推荐的M44P方案、M27A方案和Etest法，三种方法均有很好的稳定性，我科经过实际对比发现M44P方案和M27A方案有很好的一致性；但是M27A方案材料不易获得，而Etest法价格昂贵，唯独M44P方案是在普通细菌药敏试验所用的MH琼脂基础上，经补充2%的葡萄糖和0.5 μg/ml的美蓝改良而成，此法材料易得，价格便宜，操作简便，每个细菌室均可开展此项工作，且检测结果稳定、可靠，是值得基层临床微生物实验室进一步推广的一种较好的方法。

 作者：杨斌 李华 

【参考文献】
  　　［1］Pfaller MA ,Diekema DJ,Messer SA,et al.Activity of fluconazole and voriconazole against 1586 recent clinical isolates of Candida species determined by broth microdilution,disk diffusion,and Etest methods:report from the ARTEMIS global antifungal susceptibility program［J］.J Clin Microbiolo,2003,41:14401446.
　　［2］Barry AL,Brown SD. Fluconazole disk diffusion procedure for determining susceptibility of Candida species［J］. J Clin Microbiolo,1996,34:21542157.
　　［3］Bille J, Glauser MP. evalsuation of the susceptibility of pathogenic Candida specises to fluconazole.Fluconazole Global Susceptibility Study Group. Eur［J］. J Clin Microbiol Infect dis,1997,16:924928.
　　［4］Leibowitz LD,Ashbee HR,Evans EG,et al.A two year global evalsuation of the susceptibility of Candida species to fluconazole by disk diffusion［J］. Diagn Microbiol Infect Dis,2001,4:2733.
　　［5］徐英春，谢秀丽.M44P酵母菌纸片扩散法敏感试验方案的介绍［J］.中华医学杂志,2003,4：6668.