【摘要】  目的 探计对地钱愈伤组织的诱导和悬浮细胞培养的条件。方法 用MSK2和MS培养基对地钱配子体进行愈伤组织诱导，运用模糊评判对MSK2培养基生长激素组合进行综合性状评价。结果 MSK2和MS（2mg/L 6BA）均能诱导出地钱愈伤组织，其中MSK2的诱导效果较好。光照（3000～8000 lux）能有效地促进地钱愈伤组织生长。激素配比组合是0.5mg/L 2,4D+2mg/L NAA+2mg/L 6BA适合于地钱细胞生长以及次生代谢生产。 结论 地钱愈伤组织的诱导成功和悬浮细胞培养条件的建立，为探索药用苔藓植物次生代谢产物生产提供新的途径以及对苔藓植物细胞规模化培养提供新的理论指导。 
【关键词】  苔藓；地钱；愈伤组织；植物细胞培养

　　To induce callus tissues and establish suspension culture of Marchantia polymorpha L. Methods  MSK2 and MS mediums were used to induce gametophytes into callus tissues, and the fuzzy comprehensive

 evalsuation method was used to assess the optimal phytohormone combination. Results  Both MSK2 and MS (2mg/L 6BA) mediums  could induce callus tissue formation, and the MSK2 medium was superior to the MS medium for callus tissue induction. Light intensity（30008000 lux） effectively promoted the callus tissue growth. Optimal phytohormone combination for cell 

growth and secondary metabolism production was 0.5mg/L 2, 4D+2mg/L NAA+2mg/L 6BA. Conclusions  Successful induction of the callus tissues and establishment of suspension culture 

of Marchantia polymorpha L. provide a new pathway for exploring the pharmaceutical moss to 

produce secondary metabolism and new theory guidance  for suspension culture of moss cells 

on a large scale.
　　Key words: Bryophyte; Marchantia polymorpha L.; Callus tissue; Cell culture 
　　1  材料与方法
　　1.1  实验材料
　　1.1.1  无菌材料获得及愈伤组织诱导 
　　实验所用的地钱（Marchantia  polymorpha L.）配子体由本实验室提供。将培养在温室内地钱上的湿沙洗掉，流水冲洗2h，在无菌室内用无菌滤纸吸干，剪成0.5cm块状，放入7% NaClO消毒2min，无菌水冲洗3次，于培养温度为25?℃，光照时间12h/d，光强为5000lux的条件下。采用MS、MS（2mg/L 6BA）和MSK2［7］作为愈伤组织诱导培养基。以上培养基均添加0.9%琼脂，在高温灭菌前pH值调至5.8。
　　1.1.2  悬浮培养条件的建立 
　　悬浮细胞经液体培养基继代培养5代以上，作为细胞种子。选取MSK2、MS、KNOP、White、B5、Miller、1/2MSK2和1/2MS等用于筛选悬浮细胞培养基，将筛选得到对细胞生长良好培养基进行激素2,4D、NAA和 6BA（浓度0.5、1和2mg/L）组合优化，以求建立对细胞生长和次生代谢合成均为有利的悬浮培养条件。第20d取样进行各生化指标测定，重复3次。
　　1.2  实验方法
　　1.2.1  光照强度的设定 
　　将固体培养愈伤细胞置于培养温度25?℃，光照时间12h/d HPG350HX智能型植物生长培养箱（黑龙江哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）内，分别设定光照强度0、3000、5000和8000 lux来考察光照对细胞生长的影响。
　　1.2.2  pH的测定 
　　采用PHS2型精密酸度计(上海雷磁仪表厂)测定。
　　1.2.3  叶绿素(chlorophyll)含量的测定 
　　采用丙酮乙醇混合液法测叶绿素含量［8］。将10mL悬浮地钱细胞经3000r/min离心后，置于6mL丙酮和无水乙醇等比例混合浸提液中，放于暗处，室温下进行浸提，652nm处测定光密度，叶绿素含量用mg/g或mg/L表示。
　　1.2.4  细胞膜通透性的测定 
　　采用伊文思蓝（Evans blue）染色法［9］。取1g鲜细胞，用0.5mL 0.05%的伊文斯兰溶液将细胞染色5min后，PBS洗3次,以除去剩余染料，然后用含1% SDS（w/v）的50%（v/v）甲醇于50℃下水浴30min，以抽提蓝色染料，在600nm下测定吸光值。
　　1.2.5  酚类积累的测定 
　　取2mL培养基滤液，加入10mL乙酸乙酯，超声振荡后静止萃取2h，取5mL乙酸乙酯组分自然风干后，残留物溶于3mL 75% 乙醇中，在280nm下测量其吸光度，以3mL 75% 乙醇为对照，以水杨酸为标准，以1μg水杨酸在280nm处的吸光度代表一个单位的酚积累［10］。
　　1.2.6  生化指标综合评价 
　　采用模糊隶属法用多项指标对激素配比组合进行综合评价：其中：U={U1，U2……Un}为评价因素集，Rij(i=1，2……m；j=1，2……n)为评价值，i为处理，j代表各生物学性状。将各测得到的数据按公式Rij=(Rij-Rjmin)/(Rjmax-Rjmin)处理，Rjmin—指J性状中最小值；Rjmax—指J性状中最大值，得到评判模糊矩阵R。按照各性状的重要性确立各因素的权重，得权重分配集A，使权重满足归一化要求∑ni=1Wi=1，通过矩阵运算 B= R•AT。
　　1.3  统计学处理
　　所有数据均以±s表示，应用SAS统计学软件进行方差分析，采用t检验进行显著性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　2  结  果
　　2.1  地钱愈伤组织的诱导和悬浮细胞培养 
　　见图1。由图1可见。MSK2培养基第15?d就可见在地钱配子体周围已有深绿色愈伤组织产生，愈伤组织呈凝聚状，不断增多，并向培养基四周扩展及培养基内渗入，配子体不断缩小而愈伤组织愈来愈多。同样，培养在MS（2mg/L 6BA）中的地钱配子体周围也产生浅绿色的愈伤组织，只是其配子体缩小缓慢，愈伤细胞生物量没有MSK2培养基多。而在MS培养基的配子体第20d仍未见愈伤组织的产生。
　　2.2  光强对地钱愈伤组织生长的影响 
　　见表1。由表1可见，在光照3000、5000和8000lux条件下，地钱愈伤细胞生物量显著高于未光照条件下地钱愈伤细胞生物量（n=3, P＜0.05）。
　　2.3  不同培养基对地钱悬浮细胞生长和叶绿素含量的影响 
 
　　见表2。由表2可见，KNOP培养基细胞生物量最高，其次是MSK2，次之是MS培养基，而Miller等培养基的细胞生物量则要显著低于上述3种培养基（n=3, P＜0.05）。其中稀释培养基1/2MSK2和1/2MS培养基的细胞生物量则分别低于MSK2和MS培养基（n=3, P＜0.01）。
    MSK2培养基生物量高于除KNOP外的其他培养基，其叶绿素含量3.93g/L高于KNOP、Miller和MS等培养基（n=3, P＜0.05）。另外，MSK2培养基诱导愈伤组织的效果比MS（2mg/L 6BA）培养基要好（图1），因此本研究在MSK2培养基基础上，对其激素2,4D、NAA和 6BA进行不同比例组合优化，以求建立对细胞生长和次生代谢生产都较为有利的培养条件。
　　2.4  不同激素组合对地钱细胞生长及次生代谢的影响 
　　见表3。由表3可见，表中序号1和3细胞生物量高于序号10 ［MSK2（n=3, P＜0.05）］，序号6、7、8和9要低于序号10（n=3, P＜0.05），而序号2、4和5细胞生物量与序号10没有区别。同样，对于叶绿素含量来说，序号1和4叶绿素含量极显著高于序号10（n=3, P＜0.01），序号2、3、5、6和8叶绿素含量则显著高于序号10（n=3, P＜0.05），剩下的序号7和9叶绿素含量则要低于序号10（n=3, P＜0.05）。
    对次生代谢多酚含量来说，序号2、3、4、5、6、8和9多酚含量要高于序号10（n=3,P＜0.05），而序号1和7多酚含量与序号10差异不明显。
 
2.5  各评价因素权重 
　　按照各性状的重要性确立各因素的权重，权重分配集A=（0.75，0.02，0.05，0.03，0.2）T。
　　2.6  评价单元各评价因素的隶属度与综合评价指数 
　　见表4。由表4可见，序号3综合系数最大为0.8413，其次是序号1，其综合系数为0.8236。最小的是序号6，其综合系数为0.2199。
　　3  讨  论
    本试验结果表明，地钱配子体在第15?d就诱导愈伤组织，步聚简单，一步即可完成，减少了污染机会，优于文献报道的方法［11］。本试验结果可为其他苔类及苔藓植物细胞培养提供理论依据。
    光是调控植物生长发育的一个有效影响因子，高光强有利于配子体启动并促进其诱导愈伤组织。本试验结果表明，地钱愈伤组织细胞受到光照后，有利于增加叶绿素含量和光合效率，促进了细胞物质的吸收和代谢活动，有利于细胞增埴，细胞呈鲜绿色，并很快长满培养基质，第20d后培养基上已长满一厚层的愈伤组织。但是光强过强容易造成细胞光过氧化和破坏细胞叶绿体结构而降低光合效率，不利于细胞增殖。虽然细胞在无光源照射条件仍能生长，但是细胞细疏，颜色淡黄，其生物量显著低于光照培养（n=3, P＜0.01），并且叶绿素含量也低于有光照条件（n=3, P＜0.01）。
    
　　虽然KNOP培养基生物量是最高的，但其叶绿素含量0.13mg/L显著低于MSK2培养基的3.93mg/L和MS培养基的1.33mg/L，而且KNOP培养基细胞在第20d呈灰色，表明此时细胞进行光合作用作用较差，因此不适宜对地钱愈伤细胞进行培养。稀释一倍的1/2MS和1/2MSK2的生物量也不如MSK2和MS的好，故也不利于悬浮细胞增殖培养。
    MSK2培养基生物量仅低于KNOP培养基，而其叶绿素含量显著高于KNOP、Miller和MS等培养基（n=3, P＜0.05）。MSK2培养基诱导愈伤组织的效果优于MS（2mg/L 6BA）培养基，因此本研究选择使用MSK2培养基对地钱细胞进行悬浮培养。
    
　　因MSK2培养基只含有2，4D一种植物激素，比较单一［1213］。植物生长激素是最有效地调控细胞生长的化学物质，若按一定比例组合可以达到增效作用，从而更好地调控植物细胞的生长，因此本研究对主要激素配比进行了优化处理。结果表明，激素配比组合序号1和3对细胞的生长最为有利，但它们细胞的其它生物学性状在各自同一生化指标中并不是最好，说明仅从生物量来选择培养基不是很准确。因此，本研究在建立不同激素配比组合为主的细胞培养体系时，既考虑生物量的同时也兼顾与生物量和次生代谢相关的一些事件（pH、叶绿素含量、膜通透性和多酚），并运用模糊数学的方法对这些生化指标进行综合评判。模糊综合评价分析法不仅考虑生物量，同时还考虑与细胞生长和次生代谢相关的多个性状指标，较为全面地综合分析和评价各激素比例组合，具有可靠性和客观性。
本试验评价要素主要包括生物量以及与生物量和次生代谢有关的生物学性状：如叶绿素、膜通透性、pH和多酚。将各项指标的隶属函数的数值之和视为激素配比组合综合评价值，评价值大，配比组合效应好，反之评价值小，综合配比组合差。序号3的综合系数最大，其生物量与序号1没有显著差异，其次生代谢显著高于对照序号10，其叶绿素含量和膜通透性适中，有利于以后对细胞进行操作。因此确定，适合于地钱细胞生长和次生代谢的培养基激素配比组合是0.5mg/L 2,4D+2mg/L NAA+2mg/L 6BA，这为其他苔藓植物细胞规模化培养提供了理论依据和指导。
作者：尹德明，温学森，娄红《山东大学学报》
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