【摘要】  目的 研究热灭活状态和活菌状态嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形幽门螺杆菌(Hp)的黏附拮抗作用。方法 制备人胃上皮腺癌细胞系（AGS）细胞爬片，将两种状态嗜酸乳杆菌和不同形态Hp菌分组按不同顺序加入，作用2 h，革兰染色后光镜观察分析Hp黏附指数产生的变化，荧光抗体染色法定性评价黏附于AGS细胞的Hp密度的改变。 结果 革兰染色后光镜观察分析：排除实验组及竞争实验组与对照组比较，黏附指数均有明显下降（P<0.05）。荧光镜下可见实验组黏附于细胞的Hp密度也明显降低。 结论嗜酸乳杆菌对不同形态的Hp均具有黏附拮抗作用。

【关键词】  乳杆菌,嗜酸;螺杆菌,幽门;上皮细胞;胃肿瘤;细菌黏附;荧光抗体技术

The Antagonism Effect of Lactobacillus Acidophilus on Adherence of Helical and Coccoid Forms of Helicobacter pylori

　　WU Xiaoqian, SHE Feifei, LI Neng,CHEN Yuexiu

　　Department of Pathogeny Biology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China

    ABSTRACT:  Objective  To investigate the antagonism effect on adherence of the helical and coccoid forms of Hp to the gastric epithelial cell by the inactivated and living Lactobacillus acidophilus.  Methods  The AGS cellseeded coverslips were prepared, then the two different status of Lactobacillus acidophilus and two different forms of Hp were added in different order. 2 hours later, the bacteria were Garm's stained, and the adherence of Hp to AGS cell were observed by microscope and the adherence index was calculated. At the same time, by using FITCconjuncted antibody, the density of the adhered two different forms of Hp was evalsuated under the fluoscence microscope after treatment with inactivated and living Lactobacillus acidophilus.   Result  Compared with the control group, the adherence indexes of the competition test group and the exclusion test group were much lower（P<0.05）, and the density of the adhered two different forms Hp of test groups were much lower than that of the control group.  Conclusion   Lactobacillus acidophilus had antagonism effect on cell adherence of helical and coccoid forms of Hp.
     幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)存在2种形态：螺旋野生形和球形变异形。在不利于其生长繁殖的环境中，螺旋形Hp可转变为球形。球形Hp在细菌的传播及致病中也起着重要作用。笔者拟从细菌感染的第一步，即嗜酸乳杆菌对2种形态Hp的黏附能力的影响探讨将嗜酸乳杆菌同时作为预防和治疗Hp感染常规辅助手段的可行性。

　　1  材料与方法

　　1.1  菌株与培养 

　　嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus标准株6075源自中国工业微生物菌种保藏中心。Hp国际标准株NCTC11637为本系保存。

　　1.1.1  嗜酸乳杆菌制备 

　　采用MRS液体培养基在厌氧环境下37 ℃静止培养36 h，收集菌液分为活菌和灭活2组，灭活组经75 ℃水浴灭活30 min。无血清无双抗的F12高糖培养液重悬。

　　1.1.2  螺旋形Hp制备 

　　用含5%新鲜脱纤维羊血的布氏血平板上（含万古霉素10 μg/mL，多粘菌素B  2.5 IU/mL，TMP  5 μg/mL），37 ℃微氧环境中培养和传代。传代后再培养2 d的螺旋形Hp以PBS洗下，无血清无双抗的F12高糖培养液重悬。

　　1.1.3  球形Hp制备 

　　将Hp传代后再培养2 d，用布氏肉汤（含10%小牛血清）洗下细菌，制成菌悬液。加入灭滴灵（终浓度8 μg/mL），37 ℃微氧环境培养，直至Hp全部转为球形（约60 h）。经显微镜下观察及再培养无菌生长，确定为Hp已完全球变。以无血清无双抗的F12高糖培养液重悬细菌备用。

　　1.2 细胞培养和细胞爬片制备 

　　人胃上皮腺癌细胞系AGS细胞由本系保存，培养液为含10%胎牛血清的F12高糖培养液（含10%胎牛血清，青霉素200 IU/mL，链霉素50 μg/mL）。置于体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，隔天传代，实验所用细胞均处于对数生长期。于6孔板内置盖玻片，每孔接种1×105 mL-1密度的细胞液2 mL，过夜培养，制成爬片。

　　1.3 兔抗Hp11637多克隆抗体制备 

　　超声粉碎菌体后，自家兔耳缘静脉隔周免疫4次后抽心脏血制备血清。间接ELISA法检测抗体的效价：以Hp11637超声抗原包被96孔酶联板，对待测血清进行1∶100～1∶51 200倍比稀释后检测。Western blot检测抗体的相对特异性：将嗜酸乳杆菌6075裂解物行SDSPAGE电泳，以待测血清做一抗。

　　1.4  不同状态嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形Hp黏附拮抗研究

　　1.4.1  光镜观察并计算黏附指数

　　1.4.1.1  观察分析不同状态的嗜酸乳杆菌对AGS细胞的黏附情况 

　　将活菌和热灭活状态的嗜酸乳杆菌加入6孔培养板中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2环境中与AGS细胞作用2 h。每孔菌液2 mL，细菌浓度为5×107 CFU/mL。作用完毕后，取出细胞爬片，PBS洗3次，常规革兰染色后于油镜下观察并随机计数50个细胞上活菌或热灭活状态的嗜酸乳杆菌的黏附数量。推算出每个上皮细胞的黏附指数：

黏附指数=黏附嗜酸乳杆菌数/细胞数

　　1.4.1.2  通过排除、竞争、替换实验观察分析不同状态的嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形Hp黏附能力的影响 

　　（1）排除实验组：将活菌和热灭活状态的嗜酸乳杆菌加入6孔培养板中，在37 ℃，体积分数为0.05的CO2环境中与AGS细胞作用1 h，去除未黏附的嗜酸乳杆菌,然后再分别加入螺旋形Hp、球形Hp悬液，继续孵育1 h；(2)竞争实验组：分别将螺旋形Hp、球形Hp悬液与嗜酸乳杆菌活菌组或灭活组悬液同时加入6孔培养板中混匀，37 ℃、体积分数为0.05的CO2环境中与AGS细胞作用2 h；(3)替换实验组：将螺旋形Hp、球形Hp悬液加入6孔板中，37 ℃、体积分数为0.05的CO2环境中与AGS细胞作用1 h后，去除未黏附的螺旋形Hp、球形Hp，再加入活菌和热灭活状态的嗜酸乳杆菌悬液，混匀后继续孵育1 h。(4)对照组：将螺旋形Hp、球形Hp悬液加入6孔板中，37 ℃、体积分数为0.05的CO2环境中与AGS细胞作用2 h。每孔菌液2 mL，每孔中嗜酸乳杆菌及Hp菌量分别达到108 个。作用完毕后，取出细胞爬片，PBS洗3次，常规革兰染色后于油镜下观察并随机计数50个细胞上螺旋形Hp、球形Hp的黏附数量。推算出每个上皮细胞的黏附指数:

    黏附指数=黏附螺旋形Hp或球形Hp数/细胞数

　　1.4.2  荧光抗体染色法定性评价嗜酸乳杆菌的加入对不同形态 Hp 黏附细胞的密度影响 

　　将制备的细胞爬片分组：螺旋形Hp组、球形Hp组，对照组、如
　　1.4.1.2的排除实验组、竞争实验组、替换实验组。每孔菌液2 mL，除对照孔加2 mL无血清F12高糖培养液外，其余各组每孔中嗜酸乳杆菌及Hp菌量分别达到108 个。螺旋形Hp组、球形Hp组及对照组孵育2 h，排除实验组、竞争实验组及替换实验组孵育时间参照1.4.1.2。各组细胞片经PBS洗3次，兔抗11637多克隆抗体37 ℃作用30 min，PBS洗3次，用FITC标记的羊抗兔抗体（购自武汉博士德生物工程有限公司）作用30 min，经洗涤封片后于荧光显微镜下观察并拍照。实验重复3次。

　　1.5  统计学处理 

　　黏附指数以x±s表示，采用SPSS 12.0统计软件分析，比较采用成组t检验。

　　2 结果

　　2.1 不同状态嗜酸乳杆菌对AGS细胞的黏附情况 

　　革兰染色后油镜下观察可见：活菌状态的嗜酸乳杆菌和灭活状态的嗜酸乳杆菌均对AGS细胞具有较强的黏附活性。活菌状态的嗜酸乳杆菌黏附指数（53.00±13.14）与灭活状态的嗜酸乳杆菌黏附指数（42.00±11.47）比较，差别无统计学意义（P>0.05）。

　　2.2  不同状态嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形Hp细胞黏附指数的影响

　　2.2.1  不同状态嗜酸乳杆菌对螺旋形Hp黏附AGS细胞的影响 

　　革兰染色后油镜下可见：螺旋形Hp对AGS细胞具有很强黏附活性。嗜酸乳杆菌先于Hp（排除实验组）或同时与Hp（竞争实验组，图1A）加入细胞中，则螺旋形Hp对AGS细胞的黏附指数明显下降（P<0.05）。若嗜酸乳杆菌后于Hp（替换实验组）加入细胞中，则螺旋形Hp对AGS细胞的黏附指数无明显变化（P>0.05）。同一实验组中，加入灭活状态的嗜酸乳杆菌组与加入活菌组比较，其Hp对AGS细胞的黏附指数均较低，差别无统计学意义（P>0.05，表1）。表1  不同状态嗜酸乳杆菌对螺旋形Hp黏附AGS细胞的影响（略）

　　2.2.2  不同状态嗜酸乳杆菌对球形Hp黏附AGS细胞的影响 

　　革兰染色后油镜下可见：球形Hp虽然黏附能力略有下降，但仍保持较强黏附活性。嗜酸乳杆菌先于Hp（排除实验组）或同时与Hp（竞争实验组，图1B）加入细胞中，则球形Hp对AGS细胞的黏附指数明显下降（P<0.05）。若嗜酸乳杆菌后于Hp（替换实验组）加入细胞中，则球形Hp对AGS细胞的黏附指数无明显变化（P>0.05）。同一实验组中，加入灭活状态的嗜酸乳杆菌组与加入活菌组比较，其Hp对AGS细胞的黏附指数均较低，差别无统计学意义（P>0.05，表2）。

　　2.3  荧光抗体染色法定性评价嗜酸乳杆菌的加入对不同形态 Hp 黏附细胞的密度影响 

　　ELISA结果显示：血清抗体效价为1∶12 800；Westernblot结果显示：Hp11637裂解物出现多条条带，而嗜酸乳杆菌6075裂解物则未出现条带，无交叉反应。表明制备的血清抗体可用。荧光显微镜下可见，螺旋形及球形Hp均能够高密度的黏附于AGS细胞上，螺旋形Hp的荧光强度略高于球形Hp。加入不同形态的嗜酸乳杆菌后，排除实验组与竞争实验组中螺旋形及球形Hp的黏附密度有明显降低（图2）。表 2  不同状态嗜酸乳杆菌对球形Hp黏附AGS细胞的影响（略）

　　3 讨 论

    作为可在胃内常驻的细菌，确切安全的微生态制剂之一，嗜酸乳杆菌对Hp抗炎抑制作用国内外已有相关报道。但其机制至今尚未明确，且研究也局限于螺旋形Hp[12]。

    多项研究预示球形Hp在Hp的传播及致病甚至潜在致癌性中起着重要作用。有研究显示抗生素治疗后，球形Hp在胃中的潜伏是消化性疾病复发的重要原因之一[3]。流行病学调查显示饮用水与Hp感染关系密切，支持Hp经水传播的观点[45]，而Hp在无营养的水中3～4 d后已全部转变为球形菌[6]。有学者发现，胃癌组织中的Hp通常是以球形菌的形式存在，癌变胃组织中球形Hp的检出率显著高于溃疡病患者[7]。球形Hp被证实保存了Hp的毒力和生存活力，在条件适宜时可转化为螺旋形。因此在开发预防和根除治疗Hp感染的方法时应同时考虑到其对抗球形Hp的作用，以预防球形Hp的侵入或清除体内球形Hp。

    黏附是细菌感染的第一步。Hp只有黏附定植于胃上皮细胞表面后，才能对抗胃的蠕动及排空而不被清除，并生长繁殖和致病。阻断螺旋形及球形Hp黏附于胃黏膜上皮细胞，无疑能够对预防其感染和根除治疗起积极作用。本研究从球形和螺旋形Hp两个角度入手，研究嗜酸乳杆菌的加入对两种形态的Hp黏附胃上皮细胞作用产生的影响。

本研究结果显示：活的嗜酸乳杆菌和灭活状态乳酸菌对AGS细胞的黏附能力并没有显著差异。这与刘祥等用嗜酸乳杆菌临床分离株与SGC7901胃上皮细胞作用后结果一致[8]。无论是对螺旋形还是球形Hp，灭活状态的嗜酸乳杆菌的黏附抑制作用与活菌状态比较均呈现减弱趋势，提示除了菌体本身的因素外，嗜酸乳杆菌细胞外的代谢产物也可能部分影响Hp的黏附活性。替换实验的结果显示，一旦Hp先于嗜酸乳杆菌与上皮细胞接触，则嗜酸乳杆菌的黏附抑制作用明显减弱。提示竞争相同的细胞黏附表位是其抑制黏附的主要机制。本实验中嗜酸乳杆菌对球形Hp也具有明显的黏附抑制作用，预示其能有效阻断外源或体内抗生素使用后诱发的球变Hp在胃内的定植。球形Hp仍然保持着较强的黏附胃上皮细胞的能力，这与球形Hp保存了Hp的毒力说法相符。光镜下计数的黏附指数和荧光镜下观察可以看出，其对AGS的黏附活性略低于螺旋形，这可能与球形Hp的黏附因子的相对低表达有关。

作者：吴小茜，佘菲菲，李能，陈月秀

【参考文献】
  　[1] Rokka S,Myllykangas S,Joutsjoki V. Effect of specific colostral antibodies and selected lactobacilli on the adhesion of Helicobacter pylori on AGS cells and the Helicobacterinduced IL8 production[J]. Scand J Immunol,2008,68(3):280286.
　　[2] Zhou C,Ma F Z,Deng X J,et al. Lactobacilli inhibit interleukin8 production induced by Helicobacter pylori lipopolysaccharideactivated Tolllike receptor 4[J]. World J Gastroenterol, 2008,14(32):50905095.
　　[3] Axon A T,Moayyedi P. Eradication of Helicobacter pylori: omeprazole in combination with antibiotics[J]. Scand J Gastroenterol Suppl, 1996,215:8289.
　　[4] Baker K H,Hegarty J P. Presence of Helicobacter pylori in drinking water is associated with clinical infection[J]. Scand J Infect Dis, 2001,33(10):744746.
　　[5] Bunn J E,MacKay W G,Thomas J E,et al. Detection of Helicobacter pylori DNA in drinking water biofilms: implications for transmission in early life[J]. Lett Appl Microbiol, 2002,34(6):45404544.
　　[6] 佘菲菲,朱 苹,史碧山,等． 水中幽门螺杆菌的球形变异及其致病力[J]． 中华微生物学和免疫学杂志, 2001,21（4）：395396.
　　[7] Chan W Y,Hui P K,Leung K N,et al. Coccoid forms of Helicobacter pylori in the human stomach[J]. Am J Clin Pathol, 1994,102：503507.
　　[8] 刘祥,潘素华,张朝武,等． 嗜酸乳杆菌胃分离株WR22体外抑制幽门螺杆菌黏附胃上皮细胞研究[J]． 中国人兽共患病学报, 2006,22（3）：246248.

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