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    苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究



    录入时间:2010-12-13 9:40:41 来源:中国论文下载中心

     

    【摘要】  目的 探讨苏云金芽孢杆菌(Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bc)的亲缘关系,Bt鉴定、安全性评价及降低其致病风险等提供科学依据。方法 采用肠杆菌基因间重复一致序列-PCRERIC-PCR)技术,对6株苏云金芽孢杆菌和3株蜡状芽孢杆菌及对照菌株的基因组DNA进行扩增,对其指纹图谱进行分析;回收并克隆重复性好的苏云金芽孢杆菌基因组DNA扩增片段,以其为探针,分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。结果 与蜡状芽孢杆菌相比,苏云金芽孢杆菌菌株间基因组DNA指纹图谱较一致;所有供试苏云金芽孢杆菌菌株均扩增产生一条250bp左右的片段;苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌均可扩增产生600bp左右的共有DNA片段。此外,以苏云金芽孢杆菌500bp片段为探针与苏云金芽孢杆菌基因组DNA杂交有很好的特异性。结论 肠杆菌基因间重复一致序列-PCR指纹图谱可以正确反映苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系;500bp片段可以作为苏云金芽孢杆菌鉴定探针。

    【关键词】  苏云金芽孢杆菌

      苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis,Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus,Bc)同属于蜡状芽孢杆菌菌群,为自然界中广泛分布的革兰阳性菌〔1〕。其中Bt在其休眠期可形成对昆虫有毒性的伴胞晶体。因此,被作为生物杀虫剂广泛应用于农业及卫生害虫的生物防治;Bc则是人畜条件致病菌,可导致人食物中毒和感染,引起呕吐和腹泻〔2〕。研究表明,在自然环境中,两者染色体体外遗传物质可以出现高度重组〔3〕,在DNA水平也具有较高的同源性,只有个别碱基有差异〔4〕。由于BtBc的相似性,许多细菌分类学家认为BtBc应为同一个种〔5〕。BtBc间的同源性关系,使Bt安全性问题越来越受到人们重视。因此,为研究两者的亲缘关系,对Bt的鉴定、Bt应用的安全性评价,以及进一步提高Bt杀虫效力、降低其致病风险,本文利用肠杆菌基因间重复一致序列(ERIC)-PCR技术〔6〕对BtBc全基因组DNA进行扩增,对获得的BtBc基因组DNA指纹图谱进行分析,探讨BtBc起源进化关系,同时筛选并克隆了Bt基因组DNA扩增片段,对应用ERIC-PCR技术鉴别、鉴定BtBc进行可行性探讨。结果报告如下。

      1   材料与方法

      1.1   材料

      1.1.1   菌株   Bt 6株(菌株号为CGMCC 11749、CGMCC 11754、CGMCC 1294、CGMCC 1905、CGMCC 1989、CGMCC 11014),Bc标准株1株(菌株号为CGMCC 1126),大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等对照菌株各1株(菌株号分别为CGMCC 190、CGMCC 1933CGMCC 189)〔购于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)〕,Bc分离株2株为沈阳出入境检验检疫局分离,并经国标生化鉴定。

      1.1.2   PCR引物及试剂   (1)ERIC引物: 由大连TaKaRa生物工程有限公司合成,引物序列分别为: PrimerⅠ:5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′,PrimerⅡ:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′;(2)试剂:Ex-Taq酶、IPTG、X-gal(大连TaKaRa生物工程有限公司);pGEMT vector连接转化试剂盒(pGEM-T vectorSystem Ⅱ)及JM109高效率感受态细胞(美国Promega公司);放射性同位素〔α-32P-dCTP和随机引物DNA标记试剂盒(Random Primer DNA Labeling System,英国Biolabs公司);尼龙膜及3MM滤纸(英国Whatman公司);其他试剂为本实验室自配,均为分析纯。

      1.2   方法

      1.2.1   菌株培养及其基因组DNA的提取   斜面活化的菌株在LB 培养基中30摇床培养过液(200r/min) ,离心收集2ml 培养的菌体(4000r/min ,10min ,20) ,采用实验室常规酚/氯仿法提取各菌株基因组DNA。所提取DNABeckman DU640检测,吸光度A260/A280值在1819之间,纯度符合PCR扩增条件。  
      1.2.2   ERIC-PCR反应条件及结果鉴定   (1)反应体系组成和反应条件:依据文献方法〔7〕。PCR产物进行1
    5%琼脂糖凝胶电泳(U3V/cm;T100min)。DNA标准分子量为DL2000,PCR产物经溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统上照相。

      1.2.3   PCR产物回收与克隆   将上述扩增产物利用15%琼脂糖凝胶电泳分离。选取重复性好的Bt基因组DNA扩增片段,使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。纯化产物连于pGEM-T载体,转入JM109感受态大肠埃希菌。连接反应、转化操作以及克隆子的鉴定按照常规方法进行;阳性克隆子用NaOH/SDS碱裂解法制备质粒DNA。

      1.2.4   斑点杂交   按照随机引物DNA标记试剂盒(Random Primer DNA Labeling System)说明标记回收产物,以标记产物为探针,分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。

      1.2.5   引物设计及PCR验证   发生特异性杂交反应的克隆片段由大连TaKaRa生物工程有限公司进行测序。利用Primer Premier 50软件〔8,根据特异克隆片段序列信息设计引物,序列分别为:BthⅠ:5′CGAGCAGTAGGCGAACCATTG-3′Bth:5′TGGCATGGGCTTTCGGATATT-3′。引物对应的扩增产物长度为363bp;PCR反应条件:94预变性2min;9430s,5530s,7230s,共30循环;72延伸5min。体系同ERICPCR。以6Bt及其他对照菌株的染色体DNA作为模板,进行PCR反应。

      2   结果

      2.1   ERIC-PCR图谱(图1   6株苏云金芽孢杆菌和3株腊状芽孢杆菌的基因组DNAERIC-PCR扩增,均可产生清晰的DNA指纹图谱,扩增片段范围1002500bp,各菌株扩增图谱的多态性程度不同。Bt基因组DNA指纹图谱较一致,由3条主带构成,所有供试Bt菌株均有1250bp左右的扩增片段,而蜡状芽孢杆菌间DNA指纹图谱变异较大。另外,BtBc均可扩增得到600bp左右的共有片段。     
      1:CGMCC 1
    1749; 2:CGMCC 11754; 3:CGMCC 1294 4:CGMCC 1905; 5:CGMCC 1989; 6:CGMCC 11846 7:CGMCC 1126; 8,9:Bc分离株 B:negative control-no DNA M:DL2000

      图1   Bt、Bc基因组DNA ERICPCR结果指纹图谱(略)

      2.2   斑点杂交(图2   纯化、克隆指纹图谱中稳定出现的Bt DNA扩增片段,经DU-640测定浓度约为90μg/L,以其为探针对固定于膜上的供试菌株基因组DNA进行斑点杂交。结果显示,以500bp片段为探针,与苏云金芽孢杆菌杂交结果为阳性,枯草芽孢杆菌及属外的各菌株杂交结果为阴性。

    2.3   PCR验证(图3   根据特异克隆片段序列设计的BthⅠ和BthⅡ引物对,可以从Bt菌的基因组DNA中扩增出约360bp的片段,符合预期结果;而所有对照菌株均没有扩增条带,表明此特异片段来源于Bt菌基因组DNA。16:Bt菌株;7,8,9:Bc 菌株;10:枯草芽孢杆菌;11:大肠埃希菌;12:金黄色葡萄球菌

      图2   500bp探针对各菌株杂交放射性自显影15d照片(略)

      16:Bt菌株;7,8:Bc菌株; 9:大肠埃希菌

      图3   引物BthⅠ和BthⅡ对Bt菌及对照菌DNA的扩增结果(略)

      3   讨论

    根据本研究得到的Bt指纹图谱的保守性和Bc指纹图谱的变异性可以推测出,Bt在进化过程中出现较晚,这与Carlson等的Bt可能是获得携有cry基因质粒的Bc变种的观点相符〔9〕。从本实验的扩增图谱中还可看出,Bt亚种tolworthi HD125与其他Bt菌株的主带型一致,这一结果与Carlson Kolsto关于肠毒素基因阴性Bt菌株起源的观点一致,即Bc获得cry基因后,进化为肠毒素基因阳性Bt菌株,然后失去该基因进化为肠毒素基因阴性Bt菌株〔10〕。另外,BtBc均可扩增产生600bp左右的共有DNA片段,体现了二者在遗传上的高度同源性。因此,ERIC指纹图谱可以正确反映出BtBc的亲缘关系。由于BtBc间的同源性关系,Bt安全性问题越来越受到人们重视〔11,12〕。本研究筛选到的500bp片段可作为苏云金芽孢杆菌的鉴定用探针。 

    作者:宋树森,金莉莉,王芳

    参考文献
     
      〔1 David A Rasko,Michael R Altherr,Cliff S Han,et al.Genomics of the bacillus cereus group of organismsJ.FEMS Microbiology Reviews,2005,29:303-329.
      〔2 Lund T,Granum P E,Sullivan K O.The sequence of the non-haemolytic enterotoxin operon from bacillus cereusJ.FEMS Microbiol Lett,1999,178:355-361.
      〔3〕 袁志明,蔡全信,Andrup L,et al.苏云金芽胞杆菌肠毒素基因的PCR检测[J.微生物学报,2001,412:148-154.
      〔4 M C te Giffel,R R Beumer,N Klijn,et al.Discrimination between bacillus cereus and bacillus thuringiensis using specific DNA probes based on variable regions of 16S rRNAJ.FEMS Microbiology Letters,1997,146:47-51.
      〔5 Sergei G Bavykin,Yuri P Lysov,Vladimir Zakhariev,et al.Use of 16S rRNA,23S rRNA and gyrB gene sequence analysis to determine phylo-genetic relationships of bacillus cereus group microorganismsJ.Journal Of Clinical Microbiology,2004,8:3711-3730.
      〔6〕 金莉莉,王秋雨.ERIC-PCR技术鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌[J.中国公共卫生,2003,19(7): 879.
      〔7〕 金莉莉,王秋雨,侯萧.ERIC-PCR技术在李斯特氏菌种、菌株鉴定中的应用[J.遗传,2003,252):195-197.
      〔8〕 赵雨杰.医学生物信息学[M.北京:人民军医出版社,2002:170-175.
      〔9 Carlson,C R Caugant D A,et al.Genotypic diversity among Bacillus thuringiensis strainsJ.Appl Environ Microbiol,1994,60:1719-1725.
      〔10 Sin-ichiro A,Yuki N,Hisanori B,et al.Takashi Y.Cloning of novel enterotoxin genes from bacillus cereus and bacillus thuringiensisJ.Applied and Environmental Microbiology,1997,1054-1057.
      〔11 Granum PE,O'Sullivan K,Lund T.The sequence of the non-haemolytic enterotoxin operon from bacillus cereusJ.FEMS Microbiol Lett,1999,178:225-229.
      〔12 Bernstein L,Bernstein J A,Miller M,et al.Immune responses in farm workers after exposure to bacillus thuringiensis pesticidesJ.Environmental Health Perspectives,1999,107:575-582.

     

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