【摘要】  目的：建立以16S rRNA为靶基因的PCR反向线点杂交技术（RLB）检测淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae, NG），并与涂片法及培养法比较。方法：选择NG 16S rRNA基因设计一对PCR引物，生物素标记下游引物扩增NG DNA，然后与固定在尼龙膜上的特异性寡核苷核探针杂交。并对115例性病高危人群标本进行检测，然后与涂片法与培养法检测结果进行比较。结果：PCR扩增NG DNA的片段长度分别为414 bp。通过对115例临床标本的检测， PCR/RLB的阳性率为31.3%,而涂片法和培养法的阳性率分别为15.7%和21.7%。 结论：PCR/RLB是一种快速、敏感的检测方法，对NG感染的实验诊断具有十分重要的意义。

【关键词】  聚合酶链反应；核酸杂交；淋病奈瑟氏菌

　　The study of Comparing with Smear, Culture and PCRreverse Line Hybridization Assay for Detecting Neisseria Gonorrhoeae

　    Abstract：Objective To develop 16S rRNA PCRreverse line blot hybridization (RLB) assay for detection of N. gonorrhoeae and compare it with smear and culture methods. Methods The DNA from N. gonorrhoeae was amplified with the one set of primer for the 16S rRNA gene. The reverse primers were labeled with biotin. The products were identified by hybridization with its specific oligonucleotide probes labeled with amidogen in a nylon membrane. Then using PCRRLB to detect 115 specimens and compare it with smear and culture methods. Results The length of PCR products was 414 bp. The PCRRLB positive rate (31.3%) is higher than smear (15.7%) and culture (21.7%)(P<0.05). Conclusion The results of PCRRLB in detecting N. gonorrhoeae also provided excellent results. It plays the very important role in detecting of clinical pathogens.

    Key words：Polymerase chain reaction; Nucleic acid hybridization; Neisseria gonorrhoeae

    淋病是由淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae ，NG）感染引起的一种常见的性传播疾病（STD），约占全球STD病例的3/4，在我国亦呈逐步蔓延之势［1］。流行病学资料显示NG感染是加速HIV传播的危险因素，所以选择更加特异、敏感的检测方法对于NG的准确诊断及HIV的防治都具有十分重要的意义［2］。近年来核酸扩增技术在NG感染检测方面得到了广泛的应用,特别是PCR技术，相比于传统的培养法，核酸扩增技术具有较高的敏感性和易于标本收集转运。本文利用以16S rRNA基因作为靶基因设计PCR引物,再结合反向线点杂交技术对115份临床标本进行检测，并将结果与涂片法和培养法进行比较。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  标本来源 

　　115份性病高危人群标本来源于深圳市福永医院门诊患者，每人同时收集3份标本，1份做涂片，1份做培养，1份做PCR/RLB检测。

　　1.1.2  主要试试剂与仪器 

　　Biobyne C 尼龙膜由Pall公司生产，链亲和素过氧化物酶接合物由Roch 公司生产，Taq酶、dNTP购自MBI公司。 Eppendorf公司PCR扩增仪和Shellab杂交箱。

　　1.2  方法

　　1.2.1  涂片 

　　标本涂片自然干燥后，革兰染色镜检，找到多核白细胞内革兰阴性双球菌者为阳性。

　　1.2.2  细菌培养 

　　标本同时接种于血琼脂平板和选择性淋病奈瑟菌培养基，置5%~10%烛缸内，在36.5℃恒温箱内培养24 h~36 h，观察结果，根据菌落形态，过氧化物酶阳性，并且涂片镜检为革兰阴性球菌者为阳性。

　　1.2.3  DNA提取 

　　将标本置于含有100 μl PCR裂解液（含10 mm PH 8.0 的Tris ,4.5% Triton X100,4.5% Tween 20）的Eppendorf管中，99℃煮沸30 min后离心备用。

　　1.2.4  PCR 

　　反义引物5'端为生物素标记，特异性探针5'端用氨基标记（见表1）。PCR反应体系25 μl，含10  buffer 2.5 μl，42.5 mmol/L dNTP 2 μl，25 mol/L MgCl2 1.5 μl, 5U/μlTaq 酶0.2 μl，50 pmol引物各0.2 μl，模板5 μl，补水至25 μl。反应条件：95℃ 5 min后，95℃ 0.5 min、58℃ 0.5 min、72℃ 1 min、35个循环，最后72℃ 5 min。表1  淋病奈瑟氏菌引物和特异性寡核苷核探针序列（略）注：SLA 和SLB为引物， SLP为探针

1.2.5  制膜及探针标记
 
　　制备BiodyneC尼龙膜参见文献［3］。用0.5 mol/L NaHCO3(pH8.4)稀释opap和SL80p探针，使探针浓度分别为1.25 pmol、0.625 pmol和0.313 pmol。

　　1.2.6  RLB鉴定 

　　参见文献［3］简述之，将PCR扩增产物取5 μl加入含170 μl 2×SSPE/0.1%SDS溶液的管中，混匀后100℃煮10 min，将EP管置于冰中迅速冷却。用60℃ 2×SSPE/0.1%SDS液漂洗已标记探针的膜5 min，然后将膜置于Miniblotter上，在Miniblotter槽中分别依次加入150 μl PCR扩增产物和2×SSPE/0.1%SDS混合液。60℃杂交1 h。用60℃ 2×SSPE/0.5%SDS液洗两次，10 min/次。加入2×SSPE/0.5%SDS和1/5000链亲和素过氧化物酶接合物混合液，42℃孵育1 h，再用42℃ 2×SSPE/0.5%SDS液洗膜两次，10 min/次。再于室温入用2×SSPE液洗膜两次，5 min/次，加ECL覆盖于膜上，1 min后将膜显影5 min。

　　2  结果

    115份性病高危人群的临床标本经PCR/RLB检测其阳性率31.3%（36/115），而涂片法与培养法分别为15.7%（18/115）和21.7%（25/115）。其中11份培养法阴性标本经PCR/RLB检测为阳性，18份涂片法阴性标本经PCR/RLB检测为阳性。不同的标本类型对三种方法的检测影响不尽相同，其中前列腺液、宫颈拭子、尿道拭子和白带标本利用涂片法其阳性检出率最低，而培养法次之，而生殖道分泌物标本利用三种方法其阳性检出率差异无显著性。表2  PCR／RLB与涂片法和培养法检测淋病奈瑟氏菌的比较(略)

　　3  讨论

    本文选用了编码NG大亚基核糖体的16S rRNA基因作为检测靶基因设计引物和探针。通过对115份标本检测表明PCR/RLB阳性率最高，为31.3%，明显高于涂片法（15.7%）和培养法（21.7%），其中涂片法最低，只有15.7%，主要是对宫颈拭子、白带、前列腺液和尿道拭子标本阳性检出率较低。相比之下， 3种方法检测生殖道分泌物其阳性检出例数则无明显差别。主要原因可能是由于尿道拭子标本和前列腺液中NG含量要少于生殖道分泌物。女性淋菌性尿道炎和宫颈炎不典型，无特异性，诊断依靠病原体鉴定，阴道内有类似淋病奈瑟菌形态的杂菌，涂片难以鉴别，而培养时，敏感性也不高。

    由于PCR具有较高的敏感性，在DNA提取、PCR扩增、杂交过程是均需设立阳性和阴性对照，同时对RLB的杂交条件进行了优化。在本试验中我们以氨基标记各特异性寡核苷酸探针5'端，再与尼龙膜上的羧基结合制备成膜芯片，并通过反向线点杂交使固定在尼龙膜上的探针与含有生物素标记反义引物的5'端的PCR产物杂交，然后通过化学发光检测NG。与同位素标记探针结合放射性自显影技术相比，该技术克服了放射性污染，且具有检测信号放大作用，具有较高的敏感度。与硝酸纤维膜作为载体相比较，尼龙膜除具有结合单链及双链DNA和RNA的能力强，韧性较强，操作较方便外［4］。更重要的是可对重复用于杂交，一次杂交后，PCR产物可用1%  SDS 80℃变性而被洗脱下来，从而重复使用，极大地节约了成本和时间。

本文着重对三种检测NG的方法进行比较，相比之下PCR/RLB阳性率最高。它不仅可用于一般人群NG感染的初筛实验，而且对于女性及慢性患者有较为理想的诊断价值，值得推广应用。

作者：何大源，向华国，杨波，黄玉佳 

【参考文献】
  　［1］冯捷. 淋病的治疗进展［J］. 中国全科医学,2000,3(4):260262.
　　［2］向华国, 熊礼宽, 涂植光. 淋病奈瑟氏菌感染的实验诊断进展［J］. 重庆医学,2006,35(21): 19911997.
　　［3］Zwart G, van Hannea EJ, Kamstvan AM,et al. Rapid screening for freshwater bacterial groups by using reverse line blot hybridization［J］.Appl Environ Microbiol,2003,69:58755883.　　
　　［4］卢圣栋.现代分子生物学实验技术［M］.第2版.北京:中国协和医科大学出版社，2004.

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