摘要： 目的 检测临床分离猪源致病性沙门菌四环素的耐药基因，确定沙门菌四环素耐药基因类型。方法 用KB法测定分离株对四环素等21种抗生素的耐药情况，用PCR方法检测四环素耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG及tetK，并对扩增产物进行测序。结果 临床分离株全部对四环素耐药，33株沙门菌中有29株扩增出tetB特异性片段，基因序列与参考菌的同源性为99%，tetB检测与药敏试验阳性符合率为879%。结论 tetB的PCR检测对四环素耐药性具有较高的特异性，tetB基因是决定本试验中临床分离株四环素耐药的主要基因，为四环素耐药性的分子流行病学监测提供了依据。
关键词： 沙门菌； 四环素耐药基因； tetB； PCR； 猪
PCR amplification of tetB gene for pathogenic Salmonella isolated from diseased pigs
ABSTRACT Objective To detect the tetracycline resistance genes for 33 Salmonella isolates from diseased pigs and define the tetracycline resistance determinants. Methods The resistance of Salmonella isolates were detected by drug susceptibility tests with KirbyBauer (KB) diffusion method. PCR was designed to detect tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetG and tetK. The amplified products were sequenced and alignment analysis was performed. Results The detection of tetracyclineresistance of 33 Salmonella isolates showed the resistance rate was 100%, but only the tetB was amplified from 29 of 33 isolates. The gene fragment shared 99% homology in nucleotides with the reference sequence. The result of PCR amplification was 879% identical with that of the drug resistance test. Conclusion The tetB was the main determinant responsible for tetracycline resistance in this study and PCR detection of tetB is a specific and reliable method for molecular epidemiology of tetracycline resistance in Salmonella.
KEY WORDS Salmonella; Tetracyclineresistance genes; tetB; PCR; Pigs
自20世纪40年代抗生素问世以来，它在各种常见细菌性疾病的治疗中发挥了不可磨灭的作用。但随着兽用抗生素在养殖业的广泛应用，它的不良影响和对人类的伤害逐步显现出来［1］。在人和动物的肠道内存在着许多相互制约、处于平衡状态的正常菌群，长期过度使用抗生素导致菌群失调，产生耐药菌群，即便已经停止使用相应抗生素，这些耐药菌仍然继续传播耐药性。同时致病菌的耐药性可导致原本有效的抗生素临床治疗失败［2］。四环素作为一种廉价的广谱抗生素，几乎占领了三分之二的兽药领域。随着它的广泛应用，其耐药性便成为首当其冲的问题［3］。沙门菌是一种重要的肠道病原菌，分布广，危害大，动物沙门菌是世界各地人类食物中毒的主要致病菌［4］，因此，动物沙门菌的多重耐药性对动物与人类健康造成严重威胁。检测四环素耐药基因(tet)是监测四环素耐药性的重要手段。细菌的四环素耐药基因有数十种之多，随着细菌与宿主种类、地理环境不同而呈现多样性分布［5～8］。代敏等报道从某些规模化猪场分离的猪源致病性沙门菌的四环素耐药基因以tetC为主［9］。本实验室临床分离了数十株致病性猪源沙门菌，主要来自于湖北地区(18株)，涉及七个省市。其四环素耐药基因是否与上述报道呈现差异尚不清楚。本文用PCR技术对四环素耐药基因进行检测，以期发现四环素耐药基因的分子流行病学规律，为有效控制沙门菌感染提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒猪源沙门菌分离株33株，为本实验室从临床疑似沙门菌病的病猪中分离，经培养特性和生化特性鉴定及血清型定型确定为不同血清型沙门菌，其中猪霍乱沙门菌21株、鼠伤寒沙门菌8株、猪伤寒沙门菌2株、剑桥沙门菌1株及山夫登堡沙门菌1株。药敏试验质控菌大肠埃希菌(ATCC25922)及金黄色葡萄球菌(ATCC25923)购自杭州天和微生物试剂有限公司。大肠埃希菌ER2738［F′ lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf∶∶Tn 10(TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lacproAB)Δ(hsdMSmcrB)5 (rk- m k- McrBC-)］为四环素耐药基因tetB的阳性参考菌。质粒pBR322 (GenBank登录号J01749)为tetC的阳性对照。
1.2 主要试剂MH琼脂、抗生素药敏纸片与SS琼脂等购自杭州天和微生物试剂有限公司，LB培养液、TaqE、dNTP等购自大连宝生物有限公司。
1.3 方法(1)药敏试验 药敏实验采用KirbyBauer(KB)纸片扩散法［10］。以大肠埃希菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923为药敏质控菌，依据美国实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)2003年颁布的判定标准区分耐药(R)、中介(I)、敏感(S)等三种药物感受状态。所用抗生素包括①氨基糖苷类：阿米卡星(AMK)，庆大霉素(GM)，卡那霉素(KM)，新霉素(NM)，链霉素(SM)；②氟喹诺酮类：环丙沙星(CPLX)，恩氟沙星(ENLX)，诺氟沙星(NFLX)；③β内酰胺酶类：氨苄西林(ABPC)，阿莫西林(AMPC)；④其它：红霉素(EM)，氯霉素(CP)，多西环素(DOXY)，多黏菌素B(PLMB)，利福平(RFP)，四环素(TC)，复方磺胺甲口恶唑(TMP/SMZ)等17种抗菌药。(2)四环素耐药基因的扩增及检测根据GenBank中的基因序列，并参照文献［11］报道的序列设计引物tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetK和tetG(表1)，由北京奥科生物工程公司合成。细菌在含四环素(25μg/ml)的LB液体培养基中，
表1 扩增四环素耐药基因所用引物序列（略）
F：为上游引物；R：为下游引物。
2 结果与分析
2.1 药敏实验测定药敏纸片产生的抑菌环直径，依据CLSI/NCCLS颁布的判定标准，记录沙门菌对各种抗生素的耐药性。结果表明，33株沙门菌均表现出多重耐药性，对四环素的耐药率为100%(表2)。
2.2 耐药基因的扩增用设计的7对引物对33株沙门菌进行四环素耐药基因扩增，结果从29株细菌中扩增出tetB产物，大约700bp，与欲扩增的目的片段预测大小一致(图1、图2)。药敏试验与tetB基因检测的阳性符合率为879%(29/33)。4株tetB阴性的沙门菌血清型分别为：剑桥沙门菌、山夫登堡沙门菌、猪伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌。进一步对tetB扩增片段进行测序鉴定，结果显示，参考菌大肠埃希菌ER2738的四环素耐药基因与分离株的tetB的同源性为99%，与GenBank中的发表序列(登录号：AF326777，AJ278685，AB089595)的同源性为99%，说明扩增到的片段为tetB基因片段，且tetB为一较保守的基因。以质粒pBR322(GenBank登录号J01749)为阳性对照， 对tetC进行PCR扩增。 虽然本研究从pBR322中成功扩增出tetC基因的特异性片段，但所有沙门菌分离株均未扩增出tetC特异条带。用梯度PCR对tetA、tetD、tetE、tetG、tetK基因进行扩增，均未获得特异性产物。
表2 猪源致病性沙门菌的多重耐药性（略）
图1 22株沙门菌tetB的PCR扩增结果（略）
图2 7株沙门菌tetB的PCR扩增结果（略）
3 讨论
对临床分离的33株猪致病性沙门菌进行药敏分析，发现所有菌株均有多重耐药性，表明猪源沙门菌的耐药性相当严重。因为这些分离株均来自临床疑似沙门病的发病猪，临床治疗固然在这些沙门菌的耐药性产生中起重要作用，但饲料抗生素添加剂的作用也不容忽视。沙门菌是导致人类食物中毒的主要细菌，在许多国家均位于食物中毒病原微生物之首［12，13］，加之猪肉在我国肉类总产量中占有约2/3的比例，所以猪源致病性沙门菌的严重多重耐药性应引起高度重视。四环素类为广谱抗生素，通过结合在核糖体上，阻止氨基酰tRNA(aminoacyltRNA)与核糖体位置A结合，从而抑制蛋白质的合成，在医学与兽医学上广泛用于治疗革兰阴性菌、阳性菌感染及衣原体、支原体、立克次体与某些原虫感染［14］。本研究中所检测的沙门菌分离株100%对四环素具有耐药性，可能与四环素的广谱特性及大量使用有关。细菌产生四环素耐药性的机制有多种，包括核糖体保护机制、药物排出泵机制、酶钝化机制等，由不同的四环素耐药基因(tet)决定［9，14，15］。目前已经鉴定了29种四环素耐药基因及三种氧四环素(或土霉素)耐药基因(otr)［14］。药物导出泵机制是将进入细胞内的四环素由导出泵排出细胞外，细菌表现出耐药性。与药物排出泵机制相关的耐药基因包括：tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetI、tetJ、tetZ、tet30、tet31、tetK、tetL、otrB、tcr3、tetPA、tetV和tetY等［14］。核糖体保护机制通过耐药基因编码的核糖体保护蛋白(ribosomal protection protein，RPP)发挥作用。核糖体保护蛋白将四环素从核糖体上释放出来，氨基酰tRNA可以与核糖体A位置结合，蛋白质翻译得以正常进行［15］。与核糖体保护机制相关的耐药基因有：tetM、tetO、tetS、tetW、tetQ、tetT、otrA、tetPB等［14］。与酶钝化机制有关的耐药基因有tetX。tetX编码蛋白为一种氧化还原酶，通过化学修饰四环素使四环素失去活性［14，16］。四环素耐药基因的分布存在多样性，不同细菌、宿主种类及地理位置等都表现出四环素耐药基因的差异［6］。一般认为，革兰阴性细菌的耐药机制以抗生素的导出泵机制为主［17］，对猪体内细菌及肠道菌而言，其决定导出泵的耐药性基因以tetB为主［18，19］。本研究对猪源致病性沙门菌分离株的检测结果与上述报道一致，33株细菌中有29株检出tetB基因，测序鉴定其序列与参考序列的同源性99%。tetB检测与药敏实验的阳性符合率很高，达879%，说明tetB是决定沙门菌临床分离株四环素耐药性的主要基因。对耐药沙门菌进行SDS质粒消除试验，可以使耐药性消失，说明该四环素耐药基因tetB存在于质粒上(资料未显示)。本研究未检测出tetC基因，与代敏等报道tetC介导猪源致病性沙门菌的结论不一致［9］。由于本研究所用PCR能从阳性对照(pBR322)中成功扩增出tetC，说明样本中tetC的阴性检测结果是可靠的。至于与相关报道的差异，可能与沙门菌分离株的宿主及地域来源不同有关。本研究的33株沙门菌来自于包括湖北地区在内的七个省市，分别为：湖北(18株)，福建(4株)，河南(3株)，上海(3株)，浙江(3株)，山东(1株)，河北(1株)。除了tetB与tetC外，还对tetA、tetD、tetE、tetG和tetK等耐药基因进行了扩增。为减少方法误差，所有扩增均采用梯度PCR。但是，除了tetB以外，所研究的耐药分离株中未检测到其它耐药基因。有些沙门菌经药敏试验证明具有耐药表型，但未能检测到耐药基因，这可能因为其耐药性由其它耐药基因决定或存在其它耐药机制。本试验未发现含有耐药基因但药敏分析不表现耐药性的现象，说明耐药基因检测是一种非常特异可靠的沙门菌四环素耐药性监测方法。由于四环素存在数十种耐药基因，且基因分布多样化，为了完全弄清我国沙门菌四环素耐药基因的分布现状及规律，还需进行更广泛的分子流行病学调查。
作者：刘维红 徐引弟 郭爱珍 贾爱卿 刘军发 陈焕春
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