肺炎链球菌是医学微生物实验教学中经常要用到的菌种，该菌营养要求较高且能产生自溶酶，比一般细菌难保存，常用的定期移植保存法保存效果不理想。冷冻真空干燥法虽能保存菌种数年或十年以上，但所需设备昂贵，操作复杂，一般实验室难以配备。为能建立一种操作简便、保存时间较长、勿需特殊设备的肺炎链球菌保存方法，我们就5种简便易行的保存方法进行对比观察，现报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  菌株  肺炎链球菌CMCC（B）31003。

　　1.1.2  脱脂牛奶  新鲜牛奶经反复脱脂数次后，0.07MPa高压蒸汽灭菌15min后冰箱保存备用。

　　1.1.3  脱纤维羊血  用无菌手续抽取羊颈静脉血，注入已灭菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，脱去纤维后分装于无菌小试管中备用。

　　1.1.4  动物  健康昆明种小鼠。

　　1.1.5  菌种保存管  2ml安瓿或1.5ml连盖塑料离心管，高压灭菌后烘干。

　　2  方法

　　2.1  甘油保存法  从生长良好的血平板上取2～3环肺炎球菌移入盛有0.5ml无菌甘油的小离心管中，盖上盖后用封口膜密封管口，放-20℃冰箱保存。

　　2.2  50%甘油肉汤保存法  无菌甘油与肺炎链球菌血清肉汤培养物以1：1比例混匀后取适量分装于小离心管中，于-20℃下保存。

　　2.3  脱脂牛奶保存法  用准备好的脱脂牛奶洗下菌苔，用毛细滴管吸取菌悬液向安瓿内滴入几滴，火焰封口后于-20℃下保存。

　2.4  脱纤维血保存法  用新鲜脱纤维羊血洗下菌苔，用滴管向安瓿内滴入几滴菌悬液，火焰封口后于冰箱冷冻室中保存。

　　2.5  含菌鼠肝保存法  小鼠腹腔注射0.5ml肺炎链球菌菌液24h后处死小鼠，在无菌操作条件下打开腹腔，剪取几小块肝组织放入小离心管中，封好口后于-20℃下保存。

　　3  结果

　　每种上述方法保存若干管，每个月取出一管室温自然融化后取样培养检测菌株存活情况及主要性状。几种保存方法对肺炎链球菌的保存时间见表1。以含菌鼠肝保存法肺炎链球菌存活时间最长，可达18个月左右，其余4种保存法菌存活时间不到1年。可见肝组织对菌的保护作用要优于甘油、脱脂牛奶等保护剂。

　　表1  几种保存方法保存肺炎球菌的时间（略）

　　3  讨论

    已报告的肺炎链球菌菌种保存方法有多种，基本上分为定期移植保存法、使用保护液冻存法和冷冻真空干燥法三类。冷冻真空干燥法是迄今最佳的菌种保存方法［1］，但所需专用仪器一般实验室难以配备。保护剂常用的有甘油、脱脂牛奶、脱纤维羊血等［2］，但用保护液冷冻保存肺炎球菌一般只能保存数月。肺炎球菌难以保存较长时间可能与该菌产生自溶酶有关。我室一直沿用血平板或血斜面培养物保存此菌。虽然条件不高，但移种频繁，须每半个月移种1次。操作包括羊血采集、培养基制作、接种及培养、旧菌种管的灭菌处理等，消耗较多的人力物力，而且频繁的传代接种容易导致杂菌污染及菌种变异。我们通过对5种简便易操作的保存方法效果的比较，发现采用含菌鼠肝块可将肺炎球菌保存1年以上，可大大减少传代次数，比较实用方便，且至今国内外尚未见报道，值得推广。

　　【参考文献】

　　1  张卓然. 医学微生物学.北京：科学出版社，1998，226.

　　2  蓝鸿泰.微生物学和微生物学检验.北京：人民卫生出版社，1988，123.

作者：王丹敏，吴胜吉，吴玉秀，董小青  中华医学研究杂志 2006年1月 第6卷 第1期

作者单位：300162 天津，武警医学院微生物教研室

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