【 摘要 】　目的　近年研究发现产毒霍乱弧菌的毒素基因ctxAB由其溶原性噬菌体CTXΦ编码，这种丝状噬菌体可携带ctxAB传递给无毒素基因的霍乱菌株。研究认为ctxAB基因与CTXΦ基因组中的其它基因是严格共存的。然而在本实验室研究中，于不含ctxAB基因的El Tor型霍乱弧菌（EVC）中发现部分菌株含有RS基因同源序列，为此对这些菌株作CTXΦ基因组的进一步研究。方法　以CTXΦ基因组中的ctxA、ctxB、zot、ace、cep和RS1结构基因制备探针，对ctxAB^-菌株染色体作Southern blot检测，并用PCR方法检测CTXΦ的感染受体毒素共调菌毛（Tcp）的tcpA基因。结果　发现有4株分离自河水的霍乱毒素基因阴性EVC菌株仍含有溶原噬菌体CTXΦ的基因组，为ctxA^-ctxB^-zot⁺ace⁺cep⁺RS⁺菌株，另有一株分离自病人的EVC菌株仅表现为RS⁺。这些菌株均含tcpA基因。结论　ctxAB基因并不一定与CTXΦ其它基因共存于一个菌株中，发现了在霍乱弧菌中溶原噬菌体CTXΦ基因组内可以不携带毒素基因ctxAB的存在形式。

Genome of bacteriophage CTXΦ without the presence of ctxAB exists in ctxAB^- strains of Vibrio cholerae

　　【 Abstract 】　Objective　To research on the lysogenic bacteriophage CTXΦ genome, for isogenous sequences with RS in the chromosomes were found in some strains of ctxAB^- E1 Tor biotype (EVC) isolates in this lab.Methods The DNA probes of CTXΦ genes, including ctxA, ctxB, zot, ace, cep and RS, were prepared and were used to detect the corresponding genes in the ctxAB^- strains with Southern blot analysis. The major gene of CTXΦ receptor Tcp (toxin-coregulated pilus), tcpA, was detected by polymerase chain reaction analysis.Results CTXΦ genome in the chromosomes were found in 4 isolates of ctxAB^- EVC strains from water，and 1 isolate from a patient only possessed RS sequence. tcpA of all these strains was positive.Conclusions The results suggest that ctxAB may not has a concurrent occurrence with other CTXΦ genes. A novel CTXΦ genome without ctxAB gene presents in the chromosome of V. cholerae.

　　【 Subject words 】　Vibrio cholerae　　Cholera toxin　　CTXΦ genome

　　霍乱毒素（CT）是霍乱弧菌的毒力决定因子之一，在肠道内该毒素的分泌可导致严重的腹泻。CT由A、B亚单位组成，这两个亚单位的基因ctxA和ctxB位于染色体上，并紧密相连。近年研究发现在ctxAB周围存在着多个有意义的基因结构：其上游依次存在zot^[1]、ace^[2]、cep^[3]和orfU^[4]基因，这几个基因组成的片段的两端各存在一个或多个同向重复的RS序列，也由此将两端RS序列所夹着的这个片段称为核心区(core region) ^[3，5]。RS序列编码一个位点特异的重组系统^[3，6]，在体外实验中，含RS1序列的重组质粒可整合到含18bp长的特异位点(attRS1)的霍乱弧菌染色体上。由于这类基因的特殊排列形式以及RS的功能，1996年有研究发现^〔4〕，这群基因实际上是霍乱弧菌溶原性的丝状噬菌体(定名为CTXΦ)的基因组，霍乱毒素基因是由CTXΦ编码的，并且已诱导出和观察到这种噬菌体。CTXΦ以霍乱弧菌毒素共调菌毛(Tcp，其A亚单位基因为tcpA)为受体，染色体上的attRS1序列为特异整合位点，因此会造成毒素基因在致病的和不含ctxAB的非致病菌株间的水平传播。

　　对于ctxAB、zot、ace、cep和RS等基因在霍乱弧菌菌株染色体上的共存情况，可从一个方面反映其相互关系。有些研究认为，若ctxAB基因不存在于菌株中，那么zot基因也不存在^[7，8]，提出ctx与zot和ace是严格共存的。但也发现在一些ctxAB阴性菌株中存在zot基因的情况^[9]。我们从14株国内分离的不含ctxAB基因的El Tor型霍乱弧菌（EVC）流行菌株（ctxAB^-菌株）中，发现有4株虽不含ctxAB基因，但具有zot、ace、cep和RS基因，另有一株仅含RS基因，这些结果显示CTXΦ基因组的一种不含霍乱毒素基因的新的存在形式，这对CTXΦ的来源、ctxAB的携带与转移等方面的深入研究将提出新的论据。

材料与方法

　　1.菌株： EVC CT基因天然缺失的流行菌株均为国内分离，为本室保存及检测，其来源及噬菌体-生物分型见表1。古典型霍乱弧菌（CVC）395标准株为对照菌，El Tor型86123株为EVC菌阳性对照，均已知含有ctxAB和CTXΦ的所有基因。

表1　实验用EVC ctxAB阴性菌株及其ctxA、ctxB和CTXΦ基因的检测

　　2.探针片段及标记： 检测ctxA、ctxB、ace及cep基因所用探针片段均为PCR扩增产物，根据已发表序列设计引物，于本室ABI 391 DNA合成仪上合成。各扩增片段均位于其结构基因内，产物均经1.5％低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化。ctxA和ctxB的扩增各按常规。扩增ace基因的上游引物为5-TGC TTA TGA TGG ACA CCC-3，下游引物为5-ACG GGT CAT CAA AGC CTG-3，模板用质粒pCVD371（含ace基因，美国马里兰大学菌苗发展中心JB Kaper教授惠赠），产物长263bp。扩增cep的上游引物为5-GGA ATT CTT CAT GTT TAG CTC ACT G-3，下游引物为5-CTG GAT CCC TAT TTA GCC TTA CGA AT-3，产物长267bp。

　　检测zot基因所用探针为重组质粒pBB241（JB Kaper教授惠赠）DNA经MluⅠ和Dra Ⅲ双酶切，1.0%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收850bp片段。此片段为zot结构基因中段。 RS基因检测探针为重组质粒pCT5A11（卫生部兰州生物制品研究所王秉瑞教授惠赠） DNA经BglⅡ酶切，取2.7kb片段，为RS的全部基因。以上各基因片段用地高辛（Dig）非放射性探针标记试剂盒（Boehringer Mannheim 公司产品）以随机引物法进行标记。 tcpA基因的扩增按文献〔11〕，产物长694bp，对该基因用PCR方法电泳鉴定产物。

　　3. 菌株染色体的Southern blot检测：酚、氯仿法提取各株菌的染色体，经HindⅢ完全酶切，0.7％琼脂糖电泳后，凝胶变性、转移片段至0.45μm硝酸纤维素膜（北京化工学校附属工厂产品），干烤固定DNA，以Dig标记探针检测试剂盒（Boehringer Mannheim公司产品）、用所制备的各基因探针进行杂交和显色。

结果

　　对实验菌株的ctxA及ctxB基因检测，结果CVC 395和EVC 86123菌株为阳性，其余菌株均为阴性（见图1及表1）。另外，经HindⅢ酶切染色体，395的杂交带为2条，而86123仅出现1条，均在酶切的大片段上。zot基因探针检测发现菌株395、86123、75164、86015、86016和75200为阳性，仅395表现为2条杂交带。ace和cep探针的检测结果与zot基因检测结果完全相同（图1和图2）。tcpA扩增发现所有菌株均为阳性（图3）。

　　　　RS探针的杂交表现为395,86123,75164,86015,86016,75200和77013菌株呈阳性，395出现2条杂交带而其余菌株均为1条。以前本室研究发现菌株77013仅含RS序列^[10]。在RS的序列中有一BglⅡ酶切位点，位于其序列5端约1/5处^{〔3，5〕}，在用BglⅡ完全酶切染色体后，经RS探针杂交发现菌株75164，86015，86016和75200均出现2条明显杂交带（大约5～6kb片段上），并在约10kb片段处均有一显色微弱的杂交带，可能是由BglⅡ酶切后与RS外侧染色体相连的RS序列5侧1/5短片段杂交形成。菌株77013出现了特殊的带型，为3条，且所在片段均不同于其它菌株（见图4）。目前经检测发现77013仅RS探针杂交呈阳性。

　　通过以上检测，在所研究的EVC菌株中,75164，86015，86016和75200株为ctxA^－ctxB^－zot⁺ace⁺cep⁺RS⁺菌，而77013为ctxA^－ctxB^－zot⁺ace^－cep^－RS⁺菌株，因此前4株为含CTXΦ各基因而没有ctxAB基因的菌株。经BamHⅠ、Sal Ⅰ等内切酶切染色体以及其与Hind Ⅲ组合进行的双酶切后的杂交结果（未列出），发现菌株75164，86015，86016和75200的zot、ace、cep和RS序列所在的染色体酶切片段是一致的，且4个菌株间也相同。

讨论

　　质粒、噬菌体和转座子等是细菌中常见的可移动的基因成分，目前已知有多种细菌的毒力因子（如毒素基因、侵袭性基因等）是由这些可移动的成分携带的，例如白喉棒状杆菌的白喉毒素、葡萄球菌肠毒素A、酿脓链球菌的致热外毒素C等的基因由噬菌体所携带，大肠埃希氏菌不耐热肠毒素基因、志贺氏痢疾杆菌编码侵袭力的基因在质粒上等等。由于这些成分在菌株间的移动，就有可能使不含毒力基因的菌株获得产毒能力而成为致病菌。比如有研究发现大肠埃希氏菌不耐热肠毒素（LT）基因的G+C％比值和遗传密码子的利用与大肠埃希氏菌和霍乱弧菌染色体有很大差别，认为LT基因是大肠埃希氏菌获得的外源性基因，而使之成为致病菌^[11]，而同样CT基因的G+C%比值(36.8%)与霍乱弧菌染色体的G+C%比值(45%～49%)差别也很大。由于产CT的霍乱弧菌毒素核心区基因及其两侧结构的特殊性，Waldor和Mekalanos^[4]诱导出和证明了携带ctxAB的溶原噬菌体CTXΦ。这种噬菌体以霍乱弧菌的Tcp菌毛为受体，如果染色体上同时存在18bp长的attRS序列，则噬菌体DNA可整合到霍乱弧菌染色体上，从而使不产毒素的霍乱弧菌成为产毒株。RS序列负责完成CTXΦ的调控、复制和整合功能^[6]。早先研究Zot^[1]和Ace^[2]是作为霍乱弧菌的除CT以外的致泻毒素而命名的，新的研究发现^[4]zot、ace和orfU等基因产物为形成CTXΦ所必需。

　　对于zot、ace和ctxAB基因的共存关系，Johnson等人^[7]对167株来自环境及病人的O1群和非O1群霍乱弧菌的检测，发现ctxAB基因存在时必然有zot基因的存在，而没有两者之一单独存在的情况；Faruque等^[8]认为自临床病人分离的霍乱弧菌中zot并不离开ctxAB基因而单独存在；Colombo等^[12]对临床和环境分离株的研究认为zot、ace和ctxAB基因是严格共存的；而在Karasawa等^[9]的研究中，尽管绝大多数ctxAB阳性菌株zot基因也存在，但仍在1株临床分离菌株和36株环境和食物分离菌株中发现ctxAB^-而zot⁺。

　　在我们的研究中，通过Southern blot分析，发现从一些ctxAB^-菌株中仍能检测到zot、ace、cep和RS基因，这样的4株菌均属El Tor小川型，分离自河水中。另有一株来自病人的EVC稻叶型菌株仅有RS基因，而没有其它4个基因。从它们存在的相互关系上，我们认为当存在ctxAB基因时，则也同时存在zot、ace、cep和RS等CTXΦ的基因，而存在CTXΦ基因的菌株，却不一定带有ctxAB基因，这种基因存在的非平行关系将有助于我们认识这些基因各自的来源和功能。

　　Waldor和Mekalanos^[4]以卡那霉素抗性基因作标记替换CTXΦ中的ctxAB基因，诱导产生了噬菌体CTXΦ，表明ctxAB是作为CTXΦ的携带物而存在的，在噬菌体形成中不起作用。那么我们所研究的只含zot、RS等噬菌体基因而不含ctxAB的菌株中，存在的应当是这种CTXΦ噬菌体的“原型”。一般来说，携带这种CTXΦ噬菌体“原型”的菌株，应当表现出对同源噬菌体感染的免疫力，使之难以获得ctxAB基因而转变为产CT毒株。这有待进一步研究证实。

　　菌株77013只含RS的同源序列，从DNA杂交来看至少含2个拷贝。我们另外用RS序列3'端区域设计上游引物及于5端设计下游引物，对77013染色体进行PCR扩增（结果未列出），从扩增片段大小看，认为这2个RS序列是紧密串联排列的。那么这个RS序列是残存的噬菌体成分，还是一个可单独有功能的转座因子?对此我们将作进一步的研究。

作者：阚飙 祁国明 刘延清 刘彩莲 高守一

作者单位：中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 卫生部医学分子细菌学重点实验室

　　参考文献

　　1　Baudry B, Fasano A, Ketley J, et al. Cloning of a gene (zot) encoding a new toxin produced by Vibrio cholerae. Infect Immun, 1992,60∶428-434.

　　2　Trucksis M, Galen JE, Michalski J, et al. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90∶5267-5271.

　　3　Pearson GDN, Woods A, Chiang SL, et al. CTX genetic element encodes a site-specific recombination system and an intestinal colonization factor. Proc Natl Acad Sci USA，1993,90∶3750-3754.

　　4　Waldor MK， Mekalanos JJ. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science， 1996,272∶1910-1914.

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　　6　Waldor MK, Rabin EJ, Pearson GDN, et al. Regulation, replication, and intergration functions of the Vibrio cholerae CTXΦ are encoded by region RS2. Mol Microbiol, 1997,24(5)∶917-926.

　　7　Johnson JA, Morris JG, Kaper JB. Gene encoding zonula occludens toxin (zot) does not occur independently from cholera enterotoxin genes (ctx) in Vibrio cholerae. J Clin Microbiol, 1993,31∶732-733.

　　8　Faruque SM, Comstock L, Kaper JB, et al. Distribution of zonula occludens toxin (zot) gene among clinical isolates of Vibrio cholerae O1 from Bangladesh and Africa. J Diarrhoeal Dis Res, 1994,12∶222-224.

　　9　Karasawa T, Mihara T, Kurazono H, et al. Distribution of the zot (zonula occludens toxin) gene among strains of Vibrio cholerae O1 and non-O1. FEMS Microbiol Lett, 1993,106∶143-146.

　　10　 刘彩莲, 祁国明, 刘延清, 等. O139霍乱弧菌的分子流行病学特征. 疾病监测，1997,12(9)∶325-330.

　　11　 Yamamoto T, Gojobor T，Yokota T. Evolutionary origin of pathogenic determinants in enterotoxigenic Escherichia coli and Vibrio cholerae O1. J Bacteriol, 1987,169(3)∶1352-1357.

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