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黄连素、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠对痢疾杆菌耐药质粒的消除作用



录入时间:2010-12-7 9:31:53 来源:《西北药学杂志》

 

 摘要 比较了黄连素二硫酸盐(BDH)、溴化乙锭(EB)、十二烷基硫酸钠(SDS)不同浓度、不同处理时间和方式对痢疾杆菌耐药质粒的消除作用。结果表明:BDH对痢疾杆菌耐药质粒的消除作用较小;EB对痢疾杆菌的耐药质粒有较好的消除作用,以连续培育法处理120h,消除率可达85%;SDS对痢疾杆菌的耐药质粒有一定的消除作用,以高温高浓度双重处理交替培养,消除率可达27%。
  细菌的耐药性是治疗细菌性疾病一个难题。我们在研究痢疾杆菌的耐药性基因定位过程中,发现黄连素、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠对痢疾杆菌耐药质粒均有不同程度的消除作用。现报告如下。
  1 材料
  1.1 菌株 20株多重耐药性痢疾杆菌,每株菌转代10管 ,共200管菌做质粒消除试验。菌株来源及鉴定见文献1。
  1.2 试剂 黄连素二硫酸盐(BDH)、溴化乙锭(EB)、十二 烷基硫酸钠(SDS)(均为进口分装,购自华美公司)。
  2 方法和结果
  2.1 质粒消除试验 采用连续培育法和高温高浓度双重 处理交替培养法。前者以Bouanchard3为基础:将菌株接种于LB肉汤中,37℃ 振荡培养6h。调整浓度至105左右,取0.1ml接种于含一定浓度消除剂的LB肉汤 中,继续振荡培养。细菌呈轻微浑浊生长时,取出菌液稀释至105;取0.1ml转种 于含同样浓度消除剂的肉汤中,继续振荡培养6h。重复上述步骤,在选定的时间内(24,4 8,120h),少量快速提取质粒DNA,电泳检查质粒消除情况。后一种方法是:将菌株接种于含一定浓度消除剂的LB肉汤中,41℃振荡培养16h。取20μl菌液,接种于2ml LB肉汤管中, 41℃振荡培养16h后;再取20μl菌液接种于含同样浓度消除剂的LB肉汤管中,41℃培养16h ;取出50μl菌液接种于5ml LB肉汤管中,37℃培养16h。以碱裂解法快速提取质粒DNA,检 测质粒消除情况。质粒未消除的,重复上述处理步骤(一个处理周期64h,两个周期128h)。比较不同浓度、不同处理方式和时间BDH、EB、SDS对质粒的消除作用,筛选最佳的消除浓度 和方法。
  2.2 质粒消除的检测 以碱裂解法2小量提 取质粒DNA,1%琼脂糖电泳,EB染色,紫外投射仪检测质粒消除情况。
  2.3 结果 若以BDH、EB为消除剂,则连续培育法效果较 好,二者的处理浓度分别为100μg/ml30μg/ml。若以SDS为消除剂,则以高温、高浓度双 重处理交替培养法效果较好,处理浓度为60μg/ml。三种试剂相比,EB对质粒的消除作用最 好,SDS次之,BDH最弱(见表1)。
    表1 三种试剂对痢疾杆菌耐药质粒的消除率(%)

消除剂

24h

48h

64h

120h

128h

BDH

0

5

/

8

/

EB

8*

20*

/

85*

/

SDS

/

/

24

/

27

  *P0.01

3 讨论
  研究结果表明:EB对痢疾杆菌质粒的消除作用最好;以连续培育法,48h消除率可达20%,12 0h可达85%,随着处理时间的延长消除率明显提高。Rubin4等报道,延长时间未能提高质粒的消除率。我们推测,这可能与他们的试验方法有关。若细菌只在含消除剂的肉汤里转种一次,在细菌数目不断增多、而消除剂浓度保持不变的情况下,每个细菌平均所受消除剂的作用实际在下降;加之代谢产物不断积累,营养成分不断减少,即使延长时间,也难以提高消除率。Smith5报道若第一次消除试验不能成功,可将试验菌株在含有消除剂的肉汤里转种几次。据此我们对Bouanchard法做了改进,使菌株在试验过程中处于相对恒定的消除剂作用之下,并保证培养基中营养的丰富和pH值相对稳定,产生了较好的消除作用。试验结果表明,黄连素对痢疾杆菌的耐药质粒也有消除作用,但消除率较低,用连续培育法处理120h,消除率只能达到8%。消除率未能随着处理时间延长而提高。我们还摸索出高温(41℃)、高浓度(60μg/ml,相当于0.006%)SDS双重处理交替培养法,即先找出能容许细菌生长的SDS的最高培养浓度,在这个高浓度下高温处理。在含高浓度SDSLB肉汤中交替传代,经反复验证,效果良好,消除率可达27%。

作者:杨春梅; 马治平; 王志鹏; 杨俭;

作者单位:兰州军区卫生防疫大队

  参考文献
  〔1〕杨春梅,马治平,王福元,等.痢疾杆菌的多重耐药性及其基因定位的研究.中国临床医药研究,1998,8:18
  〔2〕盛祖嘉.微生物的遗传学实验.北京:北京人民出 版社,1982:56
  〔3Sambrook EF, Fritsch T Manatis. Molecular cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:78
  〔4Rubin ST, Madico G, Boyce TG. Genetic basis of virulence in shigella. J Bacterial, 1976,92(3):1200
  〔5Smith HW, Karch H, Forman D. Resistance to a ntibiotics of shigella strains isolated in Somalia. J Gen Microbiol, 1976,92 (1):335

 

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