摘要 ： 目的　探讨白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中的基因调控作用。方法　经小鼠尾静脉注射白色念珠菌后，采用FCM技术测定胸腺凋亡细胞上5个凋亡相关基因(p53,bax,bcl-2,fas和 c-myc)产物的水平在不同时间组的变化。结果　p53和bax两个基因产物的水平明显增加 ； 而bcl-2， fas和c-myc基因产物的水平无明显改变。结论　白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡，可 能是经由基因调控的转录途径机制而发生,p53和bax基因在此过程起重要作用。

　

　　Abstract: Aim To investigate the gene regulation effect during the thymocytes' apoptosis induced by candida albicans. Methods FCM technique was adopted to monitor changes of five apoptosis associated genes in various time groups after intravenous injection of Candida albicans via mouse' tail. Results The dynamic observations displayed that gene product levels of p53 and bax increased significantly, while that of bcl-2, fas and c-myc revealed no statistic changes. Conclusion Candida albicans induced apoptosis of thymocytes in mice is possibly gene regulated by transcriptional pathway, and p53 as well as bax play an important role in this process.

　　Keywords： Candida albicans； thymocyte; apoptosis; gene regulation ▲

　　临床上，白色念珠菌(C.albicans)引起的医源性感染是住院患者发病和死亡的一个重要原因。我室以前的研究表明，静脉感染白色念珠菌能引起小鼠胸腺萎缩和胸腺细胞凋亡,且呈浓度和时间依赖性,同时伴有外周血淋巴细胞数量的减少^〔1〕。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL)研究发现，小鼠胸腺内凋亡细胞主要分布在胸腺皮质，髓质也有少量分布。经流式细胞术(flowcytometry,FCM)对小鼠胸腺悬液中细胞的表型测定发现，CD3＋CD4＋CD8＋T细胞的数量随时间而显著减少。这些结果提示，白色念珠菌能诱导小鼠皮质胸腺细胞凋亡，但有关白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡基因调节的研究，目前国内外未见报道。我们试图从基因水平上，阐明白色念珠菌诱导小鼠皮质胸腺细胞凋亡的机制，并采用FCM动态观察了5个凋亡相关基因(p53,bax,bcl-2,fas和c-myc)产物的水平，以及在白色念珠菌诱导小鼠皮质胸腺细胞凋亡的不同时间组中的变化。结果发现，p53和bax两个基因产物的水平明显增加；而bcl-2，fas和c-myc基因产物的水平无明显改变。

　　1　材料和方法

　　1.1材料健康雌性4wk龄昆明种小鼠,体重14～16g,常规饲养(由本校实验动物中心提供)。小鼠随机分成两大组：一组经尾静脉注射0.2mL生理盐水作为对照组，另1组注射4×106白色念珠菌作为实验组；再根据观察时间的不同，又将各大组分为5个不同的时间组,即2,6,12,18和24h5个组。

　　1.2方法

　　1.2.1白色念珠菌的制备及胸腺细胞凋亡的测定

　　将白色念珠菌ID16V1株(中国科学院菌种保存中心提供)按文献〔2〕处理,使98％白色念珠菌形成菌丝型,调整至2×1010/L的浓度。提取DNA及凝胶电泳，参照文献〔3〕的方法进行。

　　1.2.2凋亡细胞及凋亡调控基因产物的检测按文献〔4〕的方法，取胸腺单个细胞悬液滴入预泠的700mL/L乙醇中,摇匀固定细胞,做细胞核DNA荧光染色(PI)和FCM分析，每个样本分析104个细胞,观察G1峰前是否出现特征性凋亡峰,并计算凋亡细胞的百分率。另取已固定的胸腺细胞(1×106)，用PBS洗两次(1800rpm,5min)，分别加入小鼠抗p53,抗bax,抗bcl-2,抗fas和抗c-myc单克隆抗体(mAb)(美国Maco公司产品)，37℃孵育30min，PBS洗两次,加入羊抗鼠FITCIgG(美国Maco公司产品)，同上孵育、洗涤，用FCM检测相应基因产物的水平。测定的数据经BDISConsort30VerE计算机软件处理，基因产物的水平用荧光道数(channelnumber)表示。

　　实验结果采用χ-±SE表示，多组间的比较用单因素方差分析,显著性差异以P>0.05为准。

　　2　结果

　　2.1小鼠胸腺凋亡细胞的百分率小鼠经尾静脉注射4×106白色念珠菌，于2，6，12，18及24h后，分别处死小鼠，取胸腺细胞制成悬液进行FCM检测(图1)。除2h实验组未出现胸腺凋亡细胞百分率的改变外，其余几组的细胞凋亡百分率与对照组相比较均显著上升(P>0.05)。

　　2.2小鼠胸腺细胞凋亡的生化改变经小鼠尾静脉注射白色念珠菌(4×106)后，对12，18和24h实验组的胸腺细胞基因组DNA进行电泳，均出现典型的DNA梯形带(图2)。

　　2.3小鼠胸腺细胞凋亡基因产物水平的变化用FCM对对照组及不同时间实验组小鼠胸腺细胞悬液中，单个细胞基因表达产物的水平进行了分析。结果表明，p53基因产物的水平2h组无改变，而6h组已增加很明显，12h组达高峰，18h组出现回落，24h组又回升。bax基因表达产物的水平在2h和6h组均无明显改变,而12h组增加明显,18h组达高峰，24h组有所回落，但bcl-2,fas和c-myc基因产物的水平与对照组相比较均无明显的变化(P>0.05，表1)。

　　图1白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡的变化(％)

　　aP∨0.05vsCtrl;bP∨0.001vsCtrl.bdP∨0.01vs12group.

　　Fig 1 Changes of apoptotic cells in C. albicans induced apoptosis of murine thymocytes(％ )

图2白色含珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡的基因调控

　　表1　白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡中5种基因产物水平的变化

　　

　　目前所知，促进胸腺细胞凋亡的基因有p53,Nur77,c-myc,fas和fasL等,而bcl-2基因则有抑制胸腺细胞凋亡的作用。值得注意的是，细胞凋亡可经由不同的信号传导途径而发生,因此，不同诱因所致凋亡过程中基因的表达也不尽相同。我们应用FCM分析了5个与细胞凋亡有关的基因,发现白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡的相关基因主要为p53和bax。结果显示，虽2h实验组胸腺细胞未发现p53基因产物的水平有改变，但6h实验组已出现很明显的增加(P>0.01),推测p53基因转录的实际时间要大大早于6h组。从凋亡的百分率看，2h实验组无明显变化,而6h组的凋亡细胞数虽有明显增加(P>0.05)，但此时p53基因产物的水平增加得更多(P>0.01),提示p53基因产物的增加要先于细胞凋亡百分率的增加,因此，胸腺细胞的凋亡可能是通过转录途径而发生的。p53基因产物于6h出现很明显的增加,12h达高峰，18h有所下降，24h有所回升,与bax基因产物的改变(18h达高峰，24h有所回落)相比较,提示p53基因的表达早于bax基因，且两者共同作用于白色念珠菌诱导的小鼠胸腺细胞凋亡。但p53可能作用于细胞凋亡的早期，bax作用于凋亡的晚期；或是p53基因通过提高bax基因的转录，使bax/bcl-2的比值增高而进一步促进细胞凋亡^{〔5，6〕}。有文献报道，γ射线照射小鼠后，小鼠胸腺细胞中p53基因表达产物的水平显著增加，并维持48h^〔7〕；而且该基因能上调bax基因的表达和下调bcl-2基因的表达^〔8〕。bcl-2与bax属同源基因,但它们的作用恰好相反，bcl-2必需结合bax才能发生效应,bcl-2与bax表达的比值决定细胞是否发生凋亡^{〔5，6〕}。本实验结果显示，胸腺bax基因的产物增加，而bcl-2基因的产物基本保持不变(稍有下降但无统计学意义)，推测可能是bax/bax同源二聚体的比值大于bcl-2/bax异源二聚体的比值^{〔5，6〕}，而促进胸腺细胞凋亡。至于fas和c-myc基因的作用还有待于进一步研究。虽然fas基因的产物在6h和12h组均有上升,c-myc基因产物在12h组有上升,但无统计学意义。这有可能表明，fas和c-myc基因的确未参与白色念珠菌诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的过程,也可能因为我们未能捕捉到两基因表达水平的最高点。有文献报道，胸腺内的克隆消除，在bcl-2基因缺失小鼠和不表达fas基因的lpr/lpr小鼠中均有发生,提示bcl-2和fas基因在克隆消除中，并非处于主导地位^〔9〕。由此我们推测，白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡主要是经由基因调控的转录途径机制而发生，且p53和bax基因在此过程起着重要的作用。

　　

作者：陈欲晓　韦超凡

单位：陈欲晓（湖南医科大学免疫学教研室，湖南长沙 410078）；韦超凡（湖南医科大学免疫学教研室，湖南长沙 410078

 

　　参考文献:

　　〔1〕 蒋洪敏,韦超凡,陈利玉,等.白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡的研究〔J〕.中华微生物学 和免疫学杂志, 1999;(19) 6: 451 454.

　　〔2〕 Blasi E, Puliti M, Pitzurra L, et al. Heterogenous secretory response of phagocytes from different anatomical districts to the dimorphic fungus candida albicans〔J〕 . Cell Immunol, 1994;153:239 247.

　　〔3〕 Naito M, Nagai H, Kawano S, et al. Liposome encapacilated dichloromethylene diphosphonate induces macrophage apoptosis in vivo and in vitro〔J〕 . J Leukoc Biol, 1996;60:337 344.

　　〔4〕 Darzynkiewicz Z,Gloria J, Li X, et al. Cytometry in cell necrobiology:analysis of apoptosis and accidental cell death(necrosis)〔J〕 . Cytometry,1997;27:1 20.

　　〔5〕 Kiefer MC, Brauer MJ, Powers VC, et al. Modulation of apoptosis by the widely distributed bcl-2 homologue Bak〔J〕 . Nature,1995; 374:736.

　　〔6〕 Yang E, Zha J, Jockel J, et al. Bad, a heterodimeric partner for Bcl XL and bcl-2, displaces Bax and promotes cell death〔J〕 . Cell, 1995; 80:285.

　　〔7〕 Hecker D, Page G, Lohrum M, et al. Complex regulation of the DNA－ binding activity of p53 by phosphorylation: different effects of individual phosphorylation sites on the interaction with different binding motifs〔J〕 . Oncogene, 1996; 12:953－ 961.

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