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产空泡毒素幽门螺杆菌感染的临床意义



录入时间:2010-12-3 13:22:56 来源:细胞与分子免疫学杂志

 

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡和萎缩性胃炎的重要病因之一,并与胃癌、胃淋巴瘤的发生密切相关,其中人群中的感染率超过50%,目前已被世界卫生组织列为一级致癌因子1。Hp的致癌因子包括:尿素酶、脂多糖、热休克蛋白、磷脂酶和空泡毒素(vacuolatingcytotoxin,VacA)等。其中VacA蛋白仅有部分菌株产生,可引起上皮细胞出现空泡样变及胃粘膜病变。为了解重庆地区HpVacA+株的感染与不同消化道疾病的关系,我们采用ELISA法和细胞培养法,检测了本校西南医院消化科住院患者HpVacA+株感染的情况。

  1 材料和方法

  1.1材料Hella细胞与Hp标准产毒株为本室保存。包被用VacA为本室基因工程表达产物。MeM细胞培养液为Gibico公司产品。辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(HRP羊抗人IgG)购自华美公司。酶标仪为Beckman公司产品。

  1.2方法

  1.2.1Hp菌的分离培养取消化病患者的胃粘膜标本48人份,并同时抽取外周血分离Hp菌。首次分离时,采用牛心、脑浸液固体培养基,于微需氧条件下37℃培养48h,做革兰氏染色观察形态,并做尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶试验鉴定Hp菌。常规分离血清,置20冻存待用。

  1.2.2HpVacA的活性检测分离Hp菌及VacA的收集,参照文献〔2〕进行。MeM细胞培养液(150mL/L小牛血清和100kU/L青、链霉素双抗),于37℃70mL/LCO2条件下培养Hella细胞,至计算数达108/L以上。加于96孔细胞培养板中,每孔100μL,并加入100μLVacA,于37℃70mL/LCO2条件下培养1824h。每份样品做倍比稀释(1∶10,1∶201∶160),每个稀释度测定2次。空白对照孔中加入100μLHp液体培养基上清代替Hp菌培养物的超滤上清。于光镜下计数Hella细胞的空泡样变,细胞空泡形成≥50%者判为阳性。

  1.2.3外周血清中抗VacA抗体的检测采用ELISA夹心法,操作步骤及结果判定均按照文献〔3〕进行。简要过程是:以基因工程制备的VacA蛋白包被酶标板(100mg/L),依次用牛血清白蛋白封闭,加入Hp感染患者的血清和HRP羊抗人IgG,用OPD显色后,检测A405nm值。结果判定:测试孔A405nm值-空白孔A405nm/阴性对照孔A405nm值-空白孔A405nm≥2.1者判为阳性。另将Hp产毒标准株超声粉碎后,以12000×g40℃离心20min。取上清包被作为阳性对照,以VacA稀释液包被作为阴性对照。

  2 结果

  从48例消化病患者胃粘膜及外周血中,共分离出Hp42株。分离菌VacA的活性检测表明,约有62%的菌株可产生VacA;用ELISA法检测抗VacA抗体的阳性率为45.8%。不同疾病患者的标本中分离的Hp产毒株的阳性率及不同Hp菌感染患者标本产生VacA的活性,以及血中抗VacA抗体的滴度均不相同,结果见表1。

1不同疾病患者标本中分离的Hp产毒株

病种

n

分离的

VacA+株

VacA+活性抗

VacA抗体

 

 

Hp

感染率()

滴度( ±S)

阳性率()

胃溃疡

18

16

61

58±10.52

44.4

十二指肠溃疡

12

10

50

32±8.75

58.3

慢性胃炎

8

6

12.5(1/8)

20

25.0

胃癌

10

10

80

65±16.36

70.0

  3 讨论  本研究证实,Hp菌的培养上清可诱导Hella细胞空泡形成,其产毒素株的阳性率为62%,与Leunk2的报道相似。抗VacA抗体的检出,可间接说明不同Hp菌株产生的VacA的活性有差异。消化性溃疡、胃癌患者感染Hp产毒株的阳性率和抗VacA抗体的检出阳性率高于慢性胃炎组(P∨0.01),提示VacA与较严重的胃粘膜病变有关。

  VacA是一种相对分子质量(Mr)87000的蛋白质,由Mr136000的前体水解而形成。其对胰蛋白酶敏感、不耐热,可引起组织细胞出现空泡和变性环死。Atherton4发现,VacA基因有3种不同的信号区和2个不同的中间区(S1a,S1b,Si,m1m2),其等位基因有5种重组体(sla/m1,sla/m2,slb/m1,slb/m2s2/m2)。其中只有s1/m1产生的VacA活性高;而s2/m2株几乎测不到细胞毒性,说明VacA的表达及活性与其基因亚型有关。临床上发现,约有60Hp可产生VacA,也是由于VacA基因亚型的不同所致。本实验中,抗VacA抗体的阳性率低于Hp菌的感染率,也说明不同基因亚型产生的VacA活性不同,诱发机体产生免疫应答的程度不同所致。Timothy5VacA蛋白的N端氨基酸序列分析发现,VacA与大肠杆菌K+Na+ATP酶的β链、人K+-NaATP酶的α亚单位及人胃K+Na+ATP酶的α亚单位等离子通道或转运蛋白部分同源。由于胃酸的分泌是由壁细胞H+K+ATP酶所介导,因此,VacA可能通过作用于壁细胞中的H+K+ATP酶而影响胃酸的分泌,从而使Hp菌逃避胃酸对其损害,定植于胃粘膜上。另外,细胞膜内外K+Na+浓度的维持需K+Na+ATP酶;而K+Na+浓度的变化又可通过影响细胞中细胞器的毒素系统而导致VacA异常分泌,引起上皮细胞空泡样改变。VacA诱导上皮细胞空泡样改变的机制,可能是干扰了细胞膜内外K+Na+的正常转运,使膜内外K+Na+浓度发生异常变化而导致VacA异常释放。

  VacAHp致病性中的作用,尤其是其与消化性溃疡及胃癌的关系已引起众多学者的重视。早期诊断并消除VacA+株感染,可大大降低消化性溃疡和胃癌的发病率。进一步阐明VacA蛋白的结构、功能及其致病机制,对Hp与胃炎、消化性溃疡和胃癌的病因学关系,以及对Hp感染的选择性治疗都将有十分重要的意义。另外,还可研制VacA佐剂疫苗,通过消除Hp感染,治疗消化性溃疡和预防胃癌的发生。

  作者简介:鲁东水,男,36岁,实验师重庆市高滩岩,Tel.(023)68752315

  参考文献:

  〔1〕 范 学 工 , 夏 华 向 . 幽 门 螺 杆 菌 感 染基 础 与 临 床 〔M .长 沙 : 湖 南 科 学 技 术 出 版 社 , 1997: 7 37.

  〔2 leunk RD, Johnson PT, David BC, et al. Cytotoxin activity in broth culture filtrates of Campylobacter pyloriJ . J Med Microbiol, 1988; 26: 93.

  〔3 Easton KA, Brooks CL, Morgan DR, et al. Serology detection of antibodies to Helicobacter pylori in children and adolescents using ELISAJ . Infect Immun, 1991; 59: 2470 2475.

  〔4 Tummuru MKR, Cover TL, Blase MJ. Cloning and expression of a high molecular mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin productionJ . Infect Immun, 1993; 61: 1799.

  〔5 Cover TL, Tummuru, MKR, Cao P, et al. Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pyloriJ . J Biol Chem, 1994; 269: 10566.

  〔6 Atherton JC, Ping C, Peek PM, et al. Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strainsJ . J Biol Chem, 1996; 270: 17771.

  〔7 Timothy L, Cover TL, Martin JB, et al. Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pyloriJ . Am J Biol Chem, 1992; 267:10570 10575

 

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