摘要：利用复性速率法(Tm值法)和高效液相色谱法(HPLC法)对生化性状比较相近的椰毒假单胞菌酵米面亚种、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和椰毒伯克霍尔德氏菌共7个菌株的鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)摩尔百分含量(G+C)%进行了测定，并对这2种方法做了对比研究。结果发现，3个种的7个菌株的(G+C)%比较接近，不能否定这3个种的细菌属于同一个种。另外，HPLC法比Tm值法的准确性好，但重复性不如后者。
　　中图分类号：R155.31　TS207.4　　　　　文献标识码：B
　　文章编号：1000-8020(2000)04-0243-03
Determination of guanine plus cytosine content of Pseudomonas cocovenenans
　　subsp farinofermantans with two methods and the comparative study
　　Jiao Zhenquan, Liu Xiumei, Yang Ruifu, Guo Zhaobiao, et al.
　　(Institute of Nutrition and Food Hygiene, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100050, China)
　　Abstract：The guanine plus cytosine content(G+C) mol% of Pseudomonas cocovenenans subsp farinofermantans, Burkholderia gladioli and Burkholderia cocovenenans, which were similar in biochemical characteristics, were determined with Tm values method and HPLC method, and the comparative study of these two methods was discussed. A negative conclusion could not be made from the results. The three bacteria were the same species. The HPLC method was more accurate than the Tm values method, but the repeatability of the latter was better.
　　Key words:Pseudomonas cocovenenans subsp farinofermantans, guanine plus cytosine content
　　近10多年来，细菌分类学发展迅速，已从传统的表型分类发展为现在的系统分类和多相分类。特别是随着分子生物学理论和技术的不断完善，产生了各种遗传型分类方法，如鸟嘌呤和胞嘧啶摩尔百分含量(G+C)%、DNA-DNA杂交、质粒图谱、限制性片段长度多态性分析和16S rRNA基因序列分析等。它们主要是对细菌染色体进行直接的DNA分析或对染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度去认识细菌，从分子水平进行分类与鉴定。
　　生物遗传的物质基础是核酸，严格地说是DNA。细菌DNA由4个碱基组成，分别是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。DNA碱基组成的不同即可反映细菌之间的亲缘关系，亲缘关系疏远的细菌，它们的(G+C) %大小不同，而亲缘关系近的细菌，它们的(G+C) % 就相同或相近。测定细菌(G+C) %的方法很多，有复性速率法(Tm值法)、氯化铯密度梯度离心法、气-液相色谱法、天然DNA光谱分析法、变性DNA光谱分析法、溴化反应、酸变性和光谱分析法、双频率分析法和高效液相色谱法(HPLC法)，其中比较常用的有Tm值法和HPLC法。Tm值法是根据DNA的增色性质，测定溶解温度(Tm)即增色效应一半时的温度而获得的^［1］；HPLC法是根据细菌染色体DNA核苷酸的4种碱基在高效液相色谱图上会出现4个不同的峰，以标准的核苷酸碱基或标准菌株作为参照，根据不同的峰高和峰面积计算样品的4个碱基的含量，进而计算出细菌DNA的(G+C) %^［2］。
　　本文以生化性状比较相近的椰毒假单胞菌酵米面亚种(简称椰酵假单胞菌，Pseudomonas cocovenenans subsp farinofermantans)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)和椰毒伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cocovenenans)为例，通过Tm值法和HPLC法测定它们的(G+C) %，进而对这2种方法进行比较。
　　1　材料和方法
　　1.1　菌株
　　选用不同食物来源和不同血清型的椰酵假单胞菌5株与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌模式株及椰毒伯克霍尔菌模式株进行测定。菌株详细情况见表1。
　　1.2　染色体DNA的提取
　　将实验菌株接种于PDA固体培养基37℃培养过夜；挑取单个菌落接种于150ml液体LB培养基中，于37℃、120r/min振荡培养过夜；培养液在8 000r/min离心5min，弃去上清，稍干燥，将菌体重悬于5ml的SE缓冲液中(轻微操作)，加入10%SDS溶液1ml,于65℃水浴10min，可见菌体澄清透明；向菌悬液中加入等体积的饱和酚和二分之一体积的氯仿-异戊醇(24∶1)充分振摇，脱蛋白5min，9000r/min 4℃离心10min使溶液分层；吸取上层水相，并在水相中加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)重复脱蛋白2次，使中间无蛋白层；吸取上层水相，并在水相中加入10mg/ml的RNase 30μl，使其终浓度为100μg/ml，于37℃温箱中作用1h；加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，充分振摇，9000r/min离心10min，重复脱蛋白至中间无蛋白层；吸取上层水相，加入2倍体积的95%乙醇，用玻璃棒将丝状染色体DNA缠在玻璃棒上，干燥；将DNA溶于2ml的蒸馏水中，置于-20℃保存。
表1　实验菌株⁽¹⁾

　　注：(1) T：Type strain.模式株；ATCC：American Type Culture Collection, Rockville, MD,USA;NCIB:National Collection of Industrial Bacterial, UK.
　　1.3　利用核酸和蛋白质分析仪(Beckman公司)进行测定
　　选取大肠杆菌K₁₂作为参考菌株，0.1×SSC溶液作为空白对照；测定所提取DNA的浓度和纯度，稀释使其浓度为50～75μg/ml,A₂₆₀/A₂₈₀＞1.8；在比色杯中加入360μl的待测样品，用热隔离盖子盖牢；根据估计的Tm值，选用65℃作为起始测定温度，95℃作为终止温度，温度的上升速率为1℃/min，A₂₆₀读取速率为1次/℃；每个样品重复测定3次，取相近2次的平均值作为最终结果。(G+C)的计算公式如下：(G+C) %=(Tm_测定-Tm_K12)×2.08+51.2
　　式中Tm：仪器给出的Tm值；Tm_K12：大肠杆菌K₁₂的Tm值。
　　1.4　利用高效液相色谱法(HPLC)进行测定
　　在上面提取的DNA中加入RNaseT1(终浓度为100U/ml)，37℃作用30min；用酚-氯仿混合物进行抽提，用乙醇进行沉淀；将沉淀溶于灭菌水中，调整其浓度为1mg/ml；100℃热变性5min，立即置于冰上冷却；加入2U/ml的核酸酶P1溶液10μl，于50℃作用1 h；加入2.4U/ml的碱性磷酸酶溶液10μl于37℃作用30min；取10μl样品在高效液相色谱仪上进样；选取大肠杆菌K₁₂作为参考菌株；每个样品测定2次，如相近，则取平均值，反之，再测定1次，取相近2个值的平均值作为最终结果。
　　高效液相色谱测定条件是选用C18 RA-DIAL-PAK色谱柱，填充料为Z-MOD-ULE，流动相是0.2mol/L的磷酸二氢胺(pH4.0)与乙腈的混合液，流速为1ml/min，检测器为UV270nm的Lambda-Max Model 481 LC荧光检测器，记录仪为Shimadzu Chromatopac C-R2AX。2　结果
　　根据Tm值法和HPLC法对椰酵假单胞菌、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和椰毒伯克霍尔德氏菌进行(G+C) %的测定，相应的结果如图1和图2所示。图1中的5条曲线从上向下分别为HN2y、大肠杆菌、大肠杆菌、Co14和Sx8801，其中大肠杆菌为重复测定，从图中可以看出：实验结果比较稳定，大肠杆菌相同样品的测定结果完全一致，待测菌株比大肠杆菌的Tm值高。根据仪器给出的Tm值，利用公式得到了各个待测菌株的(G+C) %，如表2所示。图2中的4个高峰分别为dC、dG、dT和dA，仪器根据峰高和峰面积给出了待测菌株的(G+C)%，结果见表2。
图1　Tm值法测定待测菌株(G+C) %的热变性曲线
图2　HPLC法测定待测菌株(G+C) %的色谱图及保留时间
表2　待测菌株的(G+C) %

3　讨论
　　本世纪50年代末，科学工作者们就已经根据细菌染色体的A、T、G、C组成而开始测定(G+C)%作为细菌分类和鉴定的一种手段。随着研究的深入，人们发现每个生物物种都有特定的(G+C)%，如：动植物DNA中的(G+C)%的范围较窄和相似，主要集中在35%～40%，而细菌DNA的(G+C)%变动幅度很宽，可达24%～76%，但每一种细菌的变化范围较小，并且G+C含量较为稳定，不受菌龄的影响，同时也不受除去突变因素之外的生长条件等各种外界因素的影响，因而该指标被认为是细菌分类鉴定中一项很有意义的鉴别特征。目前细菌分类也已将DNA中的(G+C)%作为常规的鉴定指标之一。
　　对于利用细菌DNA的(G+C)%对其进行分类目前还没有一个大家公认的统一准则，一般可以遵循下述原则^［3］：一个种的(G+C)%的差异不大于3%～4%；一个属内的差异通常在10%～15%；若差别在20%～30%，则可以认为是不同属，甚至不同科内的细菌；如果2个菌株的(G+C)%差异大于4%，就可判定这2株菌不属于同一个种；如果2个菌株的(G+C)%差异在4%以内，则不能判定两者是否属于同一个种，因为关系相近的细菌，其(G+C)%必定相近，但关系远的细菌其(G+C)%也可能相近(G+C含量相同，它们的碱基排列顺序则不一定相同)。所以说(G+C)%在细菌分类学上的作用主要是否定。
　　本文中Tm值法的各个菌株3次测定的结果相差有大有小，大肠杆菌K₁₂作为参照菌株，3次的Tm值测定结果比较一致，为了保证测定结果的一致性，均选用测定结果相对一致的2次测定值的平均值作为最终测定结果。这7株细菌的(G+C)%范围是65.7～67.9，与伯克霍尔德氏菌属的(G+C)%范围基本一致^［4］。其中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌与椰毒伯克霍尔德氏菌的(G+C)%值分别为67.3和67.7，二者相差0.4(0.6%)，其中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的(G+C)%值(67.3)测定值与Bergey's手册上(G+C)%值(68.5)有一定的差别。椰酵假单胞菌的5个菌株的(G+C)%值为65.7～67.9，与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和椰毒伯克霍尔德氏菌的(G+C)%值非常接近，与它们相差的范围分别是0.6～1.6(0.89%～2.38%)和0.2～2.0(0.30%～2.95%)。
　　各个实验菌株的HPLC法2次的测定结果非常相近，K₁₂作为参照菌株的测定值基本一致，分别是50.9和51.1，平均值是51.0，与文献报道的比较权威的数据51.2基本一致。待测菌株中，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的(G+C)%值为68.3，椰毒伯克霍尔德氏菌的(G+C)%值为68.8，它们的(G+C)%值相差0.5～1.3(0.73%～1.89%)，其中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的(G+C)%测定值(68.3)与Bergey's手册上的(G+C)%值(68.5)基本一致；椰酵假单胞菌的5个菌株的(G+C)%值分别为68.5、67.8、69.1、69.8和65.8，与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和椰毒伯克霍尔德氏菌的值也相差不大，差值范围分别是1.5～2.5(2.20%～3.66%)和1.3～2.7(1.89%～3.92%)，只有Co18的(G+C)%值相对较低，结果导致差值范围较大。2种测定方法的Co18的(G+C)%的值均较小。
　　本文测定的各个实验菌株的(G+C)%的差值范围均在4%之内，根据它们的生化性状比较相近和(G+C)%的原则要求，我们可以得出一个结论：即不能否定这3个种可能属于同一个种。
　　另外，就这2种测定方法而言，Tm值法是物理学方法，根据的是样品的溶解温度，是一种非直接方法；而HPLC法是化学方法，根据的是裂解后的寡核苷酸碱基色谱峰的不同，是一种直接方法。Tm值法结果的可信性不如HPLC法，由于物理过程和参考菌株数值的不确定而导致产生实验误差。HPLC法的准确度很高，但重复性不如Tm值法。2种方法测得的(G+C)%有一定的差别，总的趋势是HPLC法比Tm值法的测定值要高一些，相差0.1～2.1(Co18相差0.1，Co14相差2.1)。Tm值法与HPLC法对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌与椰毒伯克霍尔德氏菌的(G+C)mol%测定结果分别是67.3、67.7和68.3、68.8。Urakami通过HPLC法测定的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的(G+C)%是67.9^［5］，Bergey's手册上的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的(G+C)%值是68.5，Zhao通过Tm值法测定在椰毒伯克霍尔德氏菌的(G+C)%是68.5^［6］。本研究的HPLC法测定结果与他们的结果比较相近。
　　Tm值法与HPLC法均具有一定的优点和缺点，(G+C)%作为细菌系统分类的一个重要的分类特征，当务之急是要对其测定方法进行标准化，采用一种分类学家都能接受的方法。但无论采用哪一种方法，比较关键的是要保证提取的DNA纯度，特别是HPLC法一定要尽量减少RNA的污染。为了做到这一点，最好是对细菌进行大量培养，采用提取大量DNA的方法。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.39570619)
　　

作者：焦振泉  刘秀梅  杨瑞馥  郭兆彪  河村好章

作者单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所 北京100050 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所!北京100050 中国军事医学科学院微生物与流行病研究所 中国军事医学科学院微生物与流行病研究所 日本岐阜大学医学部微生物教室

　　参考文献
　　1，Grimont PAD, Popoff MY, Grimont F, et al. Use of DNA reassociation in bacterial classification. Can J Microbiol, 1998,34:541-546
　　2，Kaneko T, Katoh K. Determination of the nucleotide composition of a deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography of its enzymatic hydrolysate: a review. J Microbiol Methods, 1986,4:229-240
　　3，林万明.细菌分子遗传学分类鉴定法.上海：上海科学技术出版社.1990
　　4，Yabuuchi E, Kosako Y, Oyaizu H, et al. Proposal of Burkholderia gen.nov.and transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group Ⅱ to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia(Palleroni and Holms,1981) comb.nov.Microbiol Immunol, 1992,36(12):1251-1275
　　5，Urakami T, Yoshida CI, Araki H, et al. Transfer of Pseudomonas plantarii and Pseudomonas glumae to Burkholderia as Burkholderia spp. and description of Burkholderia vandii sp.nov.Int J Syst Bacteriol, 1994,44(2):235-245
　　6，Zhao NX, Wang ET, Cheng WX, et al. Comparative description of Pseudomonas cocovenenans (van Damme, Johannes, Cox, and Berends 1960) NCIB9450^T and Strains isolated from cases of food poisoning caused by consumption of fermented corn flour in China. Int J Syst Bacteriol, 1990,40(4):452-455

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