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聚合酶链反应-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种



录入时间:2010-11-29 9:57:39 来源:《中华检验医学杂志》

 

作者:李国利  庄玉辉  赵铭  王国治  陈保文  沈小兵  胡忠义  

摘 要 目的 建立一种简便、快速、敏感和特异的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法 以16SrDNA为靶序列,采用聚合酶链反应(PCR)-反向斑点杂交检测25种分枝杆菌、11种非分枝杆菌标准株、10株分枝杆菌临床分离株和26份临床痰标本。结果 分枝杆菌、非分枝杆菌标准株经DNA扩增,分枝杆菌均出现578 bp DNA片段,非分枝杆菌除假白喉棒状杆菌可见同样片段外,其余菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出100 fg结核分枝杆菌DNA。探针特异性试验表明,17种寡核苷酸探针除pTub1、pFor1、pSme探针可见交叉杂交外,其余探针均是特异的。10株结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌临床分离株PCR-反向斑点杂交结果与常规鉴定结果相符。26份涂片阳性痰标本经该法直接鉴定为结核菌复合体。结论 16SrDNA pCR-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种快速、有效,具有较高的应用价值。

  关键词:分枝杆菌,结核;聚合酶链反应;DNA探针

  目前,国内外所采用常规的分枝杆菌菌种鉴定方法,操作复杂、费时,根据细菌生物学表型特征,采用十几项指标综合分析,需12个月方可获得种的鉴定结果,难于满足临床诊断及治疗的要求。迫切需要建立快速、可靠的分枝杆菌菌种鉴定方法。我们采用16SrDNA pCR-反向斑点杂交技术,快速鉴定分枝杆菌菌种,具有较高的应用价值。

  材料与方法

  一、材料

  1.菌株及标本来源:试验所用25种分枝杆菌标准株(1)、11种非分枝杆菌标准株(表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、假白喉棒状杆菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、卡他布兰汉菌、大肠埃希菌、星形奴卡菌、红色红球菌)来源于中国药品生物制品检定所和中国科学院微生物研究所。4株结核、6株非结核分枝杆菌临床分离株和26份临床痰标本,分别来源于上海市疾病预防控制中心和本院结核科。临床分离株已依据《全国结核病诊断细菌学检验规程》1常规方法菌种鉴定。26份痰标本涂片抗酸染色分别为+++++。

  2.16S rDNA引物及寡核苷酸探针:根据已知的各种分枝杆菌菌种16S rDNA序列片段及文献报道2-4设计引物及17种分枝杆菌寡核苷酸探针。引物Ⅰ(5′端地高辛标记)和引物之间包括了16s rDNA 578 bp片段。引物及探针序列见表1。由上海生工生物工程有限公司合成。

  二、方法

  1.探针加尾:100 μl反应体系内5X末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应缓冲液20μl,dTTP终浓度1 mmol/L,探针终浓度2 μmol/L,TdT 80 U,加双蒸水至100μl,混合后稍离心,置37℃水浴2 h,加0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)2 μl终止反应。

  2.DNA提取及PCR扩增:参照文献[5]提取标准菌株、临床分离菌株及临床痰标本DNA。在25μl反应体系内PCR扩增,10X PCR buffer 2.5 μl,引物、引物终浓度各为0.2μmol/L,4xdNTP终浓度各为0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,DNA模板1020 ng或临床痰标本DNA提取物2.5 μl,加双蒸水至25 μl。置热循环仪内94℃1 min,55℃2 min,72℃ 2 min,共40个循环。72℃延伸7 min,2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1 16srDNA引物及寡核苷酸探针序列

引物,探针

靶细菌  

序列5′-3′

引物

分枝杆菌属

GCGTGCTTAACACATGCAA

 

  (5′地高辛标记)

引物

分枝杆菌属

CGCTCACAGTTAAGCCGT

pMyc

分枝杆菌属

GGGCCCATCCCACACCGC

pTub1

结核分枝杆菌复合体

ACCACAAGACATGCATCCCG

pTub2

结核分枝杆菌复合体

TAAAGCGCTTTCCACCACAA

pAvi

鸟分枝杆菌

ACCAGAAGACATGCGTCTTG

pInt

胞内分枝杆菌

CACCTAAAGACATGCGCCTAA

pKan

堪萨斯--瘰疬

 

  分枝杆菌复合体

CAAGGCATGCGCCAAGTGG

pScr

瘰疬分枝杆菌

CAACCCACAAAGTGAGCC

pMar

海分枝杆菌

CGGGATTCATGTCCTGTGGT

pSzu

苏加分枝杆菌

CCCCAAGGCATGCGCCTCGG

pXen

蟾蜍分枝杆菌

ACCACCCCACATGCGCAGAA

pGor

戈登分枝杆菌

TGTGTCCTGTGGTCCTATTCG

pFor1

偶发分枝杆菌

ACCACACACCATGAAGCGCG

pFor2

偶发分枝杆菌

CATGAAGCGCGTGGTCATATT

pChe

龟分枝杆菌

CCACTCACCATGAAGTGTGTG

pTer

土分枝杆菌

ACCACAGAACATGCATCCCA

pSme

耻垢分枝杆菌

CATGCGACCAGCAGGGTGT

pNon

不产色分枝杆菌

CCCCAAAGAAAACCTTGGAG

  3.反向斑点杂交:(1)制膜:取加尾后的探针46 pmol按顺序点于硝酸纤维素膜上,置60℃干烤固定2 h。固定后的膜经漂洗去除未固定的探针,可立即使用,也可待干燥后保存待用。(2)杂交:点有加尾探针的膜放入反应袋中。将地高辛标记的PCR产物煮沸5 min,冰浴510 min。在各反应袋中分别加入杂交液(5×SSC,1% blocking试剂,0.1%十二烷基肌氨酸钠,0.02%SDS) 5 ml,再分别加入变性的PCR产物1015μl,混匀,闭膜,55℃孵育30 min。(3)洗膜:洗液Ⅰ(2×SSC,0.1%SDS)室温10 min2次,洗液Ⅱ(0.1×SSC,0.1%SDS)55℃10 min1次。(4)抗体结合:按说明书稀释抗地高辛抗体-碱性磷酸酶结合物(Anti-Digoxigenin-AP),与杂交后的膜室温作用30 min。(5)洗膜:缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH 7.5)室温洗膜2次,每次10 min,缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH9.5)室温洗膜1次,5 min。(6)显色:用BICP-NBT系统显色,待DNA显色,未出现本底时,用TE洗膜终止反应。结果

  1.16S rDNA引物PCR的特异性及敏感性:引物和引物ⅡPCR扩增所试分枝杆菌和非分枝杆菌标准菌株,经琼脂糖凝胶电泳后分枝杆菌均可见一条578 bp DNA带,而非分枝杆菌,除假白喉棒状杆菌可见该DNA带外,其余均未见扩增带,表明用引物和引物扩增分枝杆菌16S rDNA有较好的属特异性。取经定量的结核分枝杆菌H37RVDNA依次稀释为1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg1 fg/μl DNA,取1 μl DNA扩增,其检测敏感性为100 fg。

  2.16S rDNA寡核苷酸探针特异性:25种分枝杆菌标准株PCR扩增后反向斑点杂交结果见图1。探针pMyc与所试分枝杆菌均杂交;探针pTub2、pKan与相应的复合体菌种杂交;探针pAvi、pInt、pScr、pMar、pSzu、pXen、pGor、pFor2、pChe、pTer、pNon只与相应菌种杂交。探针pTub1与土分枝杆菌和金色分枝杆菌、pFor1与不产色分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、pSme与微黄分枝杆菌可见交叉杂交。11种非分枝杆菌标准株扩增产物与17种分枝杆菌探针均不杂交。

  3.临床分离株及临床标本检测:采用PCR-反向斑点杂交检测经常规方法鉴定的4株结核分枝杆菌、6株非结核分枝杆菌(偶发分枝杆菌1株、堪萨斯分枝杆菌2株、胞内分枝杆菌3)临床分离株,除1株常规方法鉴定为胞内分枝杆菌,PCR-反向斑点杂交试验鉴定为鸟分枝杆菌外,其余菌株鉴定结果相符合。

 26份抗酸染色阳性痰标本直接进行PCR-反向斑点杂交试验,鉴定为结核分枝杆菌复合体。

  讨论

  细菌rRNA按沉降系数分为3种,分别为5S、16S23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌染色体基因中,它的内部结构由保守区及可变区两部分组成6。其分子内存在的可变区,显示出细菌不同分类等级水平上的特异性。目前,国外关于分枝杆菌16S rDNA片段序列信息研究较多3,包括了临床标本可见到的多种分枝杆菌菌种。

  我们最初试验中选择的pTub1、pFor1除与相应菌种杂交外,与其他分枝杆菌可见杂交。交叉杂交可能是由于种特异探针与其他分枝杆菌菌种16S rDNA相应区之间错配核苷酸数量少造成的。此外,错配的位置可能也影响结果,例如,土分枝杆菌PCR产物与pTub13个核苷酸错配,与该探针杂交,而海分枝杆菌PCR产物与pTub1仅有2个核苷酸错配,但与该探针并无杂交,海分枝杆菌PCR产物和pTub1错配核苷酸之间间隔有6个核苷酸,而土分枝杆菌PCR产物与pTub1错配核苷酸之间间隔则是11个核苷酸,文献报道4配对核苷酸连续长度达到10个以上即可产生交叉杂交。因此我们重新设计了pTub2pFor2,提高了检测的特异性。pKan为堪萨斯--瘰疬复合体探针,与堪萨斯、胃、瘰疬分枝杆菌均杂交,这是由于pKan选择于16SrDNA可变区A区内,该探针与此区内堪萨斯、胃、瘰疬分枝杆菌相应DNA序列相同,故试验同时在16s rDNA可变区B区内设计了瘰疬分枝杆菌探针pScr,瘰疬分枝杆菌与pKan和与pScr均杂交,堪萨斯-胃分枝杆菌复合体只与pKan杂交,据此我们可以将其相互鉴别。胃分枝杆菌虽与pKan杂交,但胃分枝杆菌为非致病性分枝杆菌,且胃分枝杆菌为不产色菌,堪萨斯分枝杆菌为光产色菌,我们可以参照菌落色素的不同,对两者进行鉴别。鸟、胞内分枝杆菌同属RunyonⅢ群分枝杆菌,生物学表型特征极为相似,常规方法很难区别,多称其为鸟-胞内分枝杆菌复合体。我们根据DNA遗传信息差别设计的寡核苷酸探针,可以将两者鉴别。

  在实际应用中,可先将pMycpTub2联合使用,初步将结核与非结核分枝杆菌鉴别开,如疑为非结核分枝杆菌,再用一系列特异探针进行菌种鉴定。该方法为PCR与探针技术相结合,不仅可用于分离菌株及早期液体培养物鉴定。其最大的优点是可用于临床标本的直接检测及鉴定。我们用26份抗酸染色阳性痰标本的初步试验,证明该方法是可行的,在接收标本后48 h内即可报告结果,我们将继续深入研究该方法的应用价值。

  作者单位:李国利(100091北京,解放军第三九医院结核中心研究室)

  庄玉辉(100091 北京,解放军第三九医院结核中心研究室)

  赵铭(100091 北京,解放军第三九医院结核中心研究室)

  王国治(中国药品生物制品检定所)

  陈保文(中国药品生物制品检定所)

  沈小兵(中国药品生物制品检定所)

  胡忠义(上海市疾病预防控制中心)

  参考文献

  1,中国防痨协会.全国结核病诊断细菌学检验规程. 中国防痨杂志,1996, 18:80-85.

  2,Patel S, Yates M, Saunders NA. PCR-enzyme-linked immunosorbent assay and partial rRNA gene sequencing: a rational approach to identifying mycobacteria. J clin Microbiol, 1997, 35: 2375-2380.

  3,Kirschner P, Springer B, Vogel U, et al. Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence determination: report of a 2-year experience in a clinical laboratory. J Clin Microbiol, 1993, 31: 2882-2889.

  4,Kox LFF, Leeuwen J VAN, Knijper S, et al. PCR assay based on DNA Coding for 16S rRNA for detection and identification of mycobacteria in clinical samples. J Clin Microbiol, 1995, 33: 3225-3233.

  5,李国利,庄玉辉,张晓刚,等. PCR快速检测肺结核痰标本结核杆菌的评价.中华流行病学杂志,1992, 13(特刊2): 169-171.

  6,尚世强,洪文澜,俞惠民,等. 细菌DNA的聚合酶链反应扩增及反相杂交初步分型.中华医学检验杂志,1998,21:281-284

 

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