银河澳门官网入口,银河集团网址登录


银河澳门官网入口,银河集团网址登录

中文版  |   English  |   加入收藏  |   客服热线:400-0532-596
微生物技术资料
文章检索
  首页 > 微生物知识->细菌基本知识和检测方法->厌氧菌微量生化板的研制

厌氧菌微量生化板的研制



录入时间:2010-11-29 9:51:29 来源:《中国微生态学杂志》

 

作者:李建秋   吴晓岩   熊德鑫 

摘 要:利用预成酶的原理,研制厌氧菌微量生化鉴定板,用国际标准菌株检测其符合率达95.9%,重复率达96.33%。用已知引进参考菌株检测,其符合率达94.84%,重复率达94.33%,而对临床分离的革兰阴性细菌的符合率达81%,对临床分离的革兰阳性细菌符合率达90%,此法效果与国外API-20A产品效果类似,但此法具有快速,操作简便,重复性好等优点,值得在广大临床检测中推广和普及。

   关键词:厌氧菌 微量生化板 快速诊断

  早在70年代,我们就采用微量技术对微生物生化性状进行检测,以鉴定微生物的种属。从简易装置开发原理来说,它大致包括两大类产品,一类属于微量接种生长繁殖,再与培养基底物产生反应而用于微生物的生化性状的鉴定,这类装置与传统的微管法类似,如API微量系统,它就是利用微型杯的塑料板,干燥底物,使用时往杯中滴入菌悬液,经过培养一段时间后,再观察其培养基中指示剂改变情况。API系统根据对不同类细菌鉴定的需要又分成4大类,如AIP-20A系统用于鉴定厌氧菌,API-20C用于鉴定酵母菌,此套系统对厌氧菌鉴定的符合率为(8090)%。另一大类快速生化检测装置是利用预成酶的原理,根据酶与底物的专一性反应,不需依赖细菌生长,而能快速鉴定厌氧菌的生化性状,如国内熊德鑫教授的微量生化板法。我们依据微量生化板法原理加以改良,开发出厌氧菌微量生化板用于部分菌种鉴定,结果报告如下:

  1 材料与方法

  1.1 根据资料3 配制简易生化鉴定20A厌氧菌生化板若干。

  1.2 指示剂的配置 溴麝香草酚蓝-甲基红指示剂,又简称为BTB-MR液,甲基红溶液:称取甲基红20g,缓冲液加入0.02mol/L,NaOH30ml,不研磨直至甲基红完全溶解,加蒸馏水至100ml,储存于棕色瓶中放冰箱保存。0.4%溴麝香草芬蓝溶液,称取TBT0.4g,缓冲液加入0.02mol/L naOH(3035)ml,研磨直至完全溶解,加蒸馏水至100ml,储存于棕色瓶中放冰箱保存。临用时将上述两种试剂分别用蒸馏水稀释5倍后1∶1混合即可使用。

  1.3 操作

  1.3.1 被检菌液的制备 从厌氧培养48h培养物用无菌棉签洗至无菌试管中,测定菌液OD值为4.08.0(相当于15亿/ml30亿/ml)。

  1.3.2 加入菌液 现将制备菌液置振荡器上振荡(1020)sec,使其混均后再用灭菌巴氏管将菌液加入微量反应板小孔中,将反应板置湿溶器盒内35℃普通培养箱(46)h后观察结果。

  1.3.3 每次试验都设阴性和阳性对照 阴性对照用PBS液加入,内含指示剂为浅绿色;阳性对照:吲哚试验,具核梭杆菌具核亚种ATCC25586,七叶水解,脆弱类杆 菌ATCC25285,硝酸盐还原:痤疮丙酸杆菌(本室分离株);触酶试验:使用脆弱类杆菌ATCC25285;尿素酶:使用本室分离的类杆菌。

  1.4 结果判定

  1.4.1 糖发酵试验 每个试验孔加入BTB-MR液一滴,砖红色为强阳性(++),黄色为(+),绿色为阴性(-)。

  1.4.2 吲哚试验 加Kovacs试剂1滴,出现粉红色为阳性,无颜色为阴性。

  1.4.3 硝酸盐还原试验 先加入A试剂(0.5%α-奈胺后加入B试剂(0.8%磺胺酸)各一滴,出现红色为阳性(+),无颜色为阴性。

  1.4.4 七叶苷水解 黑色为阳性(+),无色为阴性(-)。

  1.4.5 尿素酶 粉红色为阳性(+),橙黄色为阴性(-)。

  1.4.6 触酶产生 在甘露醇中滴入10%H2O2,产生气泡者为阳性,不产生气泡为阴性。

  2 结 果

  2.2 用国际标准菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化板鉴定结果比较列于表1中。

1 国际标准菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化板鉴定结果比较

菌种名称

菌号

来源

实验次数

方法

符合率%

重复率%

脆弱类杆菌

ATCC25285

美国

4

API-21A

91.12

92.4

 

 

 

 

  Md

96.14

98.1

小韦荣球菌脆

ATCC25285

美国

3

AI-21A

90.05

91.13

 

 

 

 

  Md

97.12

96.44

具核梭杆菌

ATCC25285

美国

3

API-21A

90.16

92.13

 

 

 

 

  Md

95.38

97.22

牙龈普林单孢菌

ATCC25285

美国

3

API-21A

91.24

92.15

 

 

 

 

  Md

96.22

93.55

嗜酸乳杆菌

ATCC25285

美国

3

API-21A

90.08

92.16

 

 

 

 

  Md

94.73

96.34

合计(均数)

 

 

 

API-20A

90.53±0.64

91.99 ±0.50

 

 

 

 

API-20A

95.92±0.91

96.33±1.71

  2.2 已知参考菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化鉴定结果比较列于表2中。

2 已知参考菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化鉴定结果比较

菌种名称

菌号

来源

实验次数

方法

符合率%

重复率%

两歧双歧杆菌

F4

武汉轻工所

3

API-21A

93.11

92.16

 

 

 

 

  Md

95.12

94.08

婴儿双歧杆菌

B

本室保存株

3

API-21A

92.08

91.13

 

 

 

 

  Md

94.89

94616

青春双歧杆菌

A2

武汉轻工所

3

API-21A

94.12

92.18

 

 

 

 

  Md

93.72

95.12

短双歧杆菌

1228

本室保存株

4

API-21A

92.17

93.11

 

 

 

 

  Md

95.18

94.12

角双歧杆菌

1024

武汉轻工所

3

API-21A

94.13

93.16

 

 

 

 

  Md

94.92

93.12

嗜酸乳杆菌

034

本室保存株

3

API-21A

94.18

95.38

 

 

 

 

  Md

95.19

95.22

合计(均数)

 

 

 

API-20A

93.30±0.99

92.63 ±1.03

 

 

 

 

API-20A

94.84±0.56

94.68±0.62

  2.3 对临床革兰阴性菌分离株的鉴定比较列于表3中。

3 对临床革兰阴性菌分离株的鉴定比较

菌种名称

方法

鉴 定菌株数

符合菌株数

符合率%

脆弱类杆菌

API-21A

12

10

0.83

 

Md

12

9

0.75

普通类杆菌

API-21A

15

11

0.73

 

Md

15

14

0.93

多形类杆菌

API-21A

14

12

0.86

 

Md

14

13

0.93

具核梭杆菌

API-21A

11

9

0.82

 

Md

11

8

0.72

死亡梭杆菌

API-21A

8

7

0.88

 

Md

8

6

0.75

小伟荣球菌

API-21A

12

11

0.92

 

Md

12

10

0.83

合计(均数)

 

 

API-21A

83.85±0.063

 

 

 

Md

87.86±1.094

  2.4 对临床革兰阳性菌分离株的鉴定比较列于表4中。

4 对临床革兰阳性菌分离株的鉴定比较

菌种名称

方法

鉴 定菌株数

符合菌株数

符合率%

痤疮丙酸杆菌

API-21A

15

14

0.93

 

Md

15

13

0.87

乳杆菌

API-21A

10

8

0.80

 

Md

10

9

0.90

产气荚膜梭菌

API-21A

15

13

0.88

 

Md

15

14

0.94

合计(均数)

 

 

API-21A

0.87±0.067

 

 

 

Md

0.90±0.033

  3 讨 论  厌氧菌微量生化板鉴定法是利用预成酶与底物专一反应,不依赖细菌生长既能快速鉴定厌氧菌的生化方法。而API-20A仍然是定量接种被检测菌经48h培养生长后,细菌产生特异性酶与加入底物专一反应使pH改变而引起预先加入指示剂改变颜色,以鉴定厌氧菌的生化性状方法。据

  adeny使用API-20A鉴定系统证实,其符合率(8090)%,我们使用API-20A对临床分离厌氧菌株鉴定符合率达(8386)%,与国外鉴定资料类似。我们使用厌氧菌微量生化板鉴定法鉴定国际标准菌株符合率为95.92%,重复率为96.33%,均优于API-20A鉴定方法,并且此法不仅重复率及符合率高,而且具有快速鉴定特点,一般6h即可观察结果,而API-20A法需48h观察结果;同时厌氧菌微量生化板法不需要厌氧培养,置37℃培养箱中(46)h即可观察结果。可见厌氧菌微量生化板鉴定方法不需要特殊培养基,试剂用量少,成本低廉,操作简便,不需特殊仪器,待检菌株悬液且可在冰箱中保存一段时间,结果不影响,而API-20A等以往常规的管生化,操作程序繁琐,观察时间一般48h以上,待检菌株不宜保存,一般需立即进行生化鉴定。当然厌氧菌微量生化板结果受菌液浓度的影响,一般菌液浓度OD值在4.08.0(1530亿/ml)其反应最佳时间(46)h,如菌液浓度低于此浓度则需延长反应时间,如菌液浓度过高,而反应时间又长,则可能出现假阳性而使鉴定的符合率降低。总之两种生化鉴定方法各有利弊,但主快速检测这点来说还是选择厌氧菌生化反应板鉴定方法为好。

  作者单位:李建秋 黑龙江省医院,150036

  吴晓岩 黑龙江省医院,150036

  熊德鑫 北京解放军304医院,100037

  参考文献

  [1Hansen SL,Stewart RJ.J Cline microboiol,1976,4:227.

  [2Moore HB,Sutler VL,Finegold SM.J Cline microbiol 1975,7: 15.

  [3]熊德鑫编译.厌氧菌分离和坚定方法.江西科技出版社出版,1989,911.

  [4Adney WS,Jones BL.J Cline Microbial,1985,22(67):980

 

上一篇:龟分枝杆菌感染的实验室诊断

下一篇:聚合酶链反应-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种

首页 | 关于我们 | 网上商城 | 在线客服 | shchuhu.com
业务联系电话
   400-0532-596 0532-66087773
   0532-66087762 0532-81935169
邮箱:qdhbywg@vip.126.com
地址:青岛市城阳区锦汇路1号A2栋
产品技术咨询
  工作日(周一至周六8:00-18:00):
  18562658263 13176865511
  其它时段:13105190021
投诉与建议:13105190021 13006536294