【摘要】  将双糖培养基改进为三糖铁尿素斜面培养基，易于尿素酶阳性菌的结果观察。方法 在双糖培养基基础上再加入2%尿素，0.2% KH2PO4，1%蔗糖制成三糖铁尿素培养基。结果经改进后的三糖铁尿素培养基与相关的目的菌进行性能测定试验后的反应符合要求。结论 改进后的培养基易于尿素酶阳性菌的观察，可以减少单管试验。配制方法简便易行、省时省力，尤其适用于基层实验室工作。

【关键词】  双糖 尿素 培养基

    【Abstract】  Objective   To quickly detect the intestinal bacteria. Methods  The agar media of triple sugar iron (TSI) was made from 2% of urea, 0.2% of KH2PO4 and 1% of sucrose on the double sugar agar and tested for its function by using the related bacteria.Results  The target bacteria were successfully cultured by using TSI agar.Conclusion  The modified culture medium is fit to observe masculine fungi of urease and can reduce the single-valve experiment. The configuration method is easy, timesaving and laborsaving, especially suitable for the basic laboratory.

    【Key words】  Double sugar iron; urea; culture medium

    为了能简便快速的鉴定出肠道致病菌，以满足基层实验室的需求，我们根据现有的双糖铁琼脂培养基进行改良配制后，选用各不同生化反应的肠杆菌科的目的菌株对改进后的培养基进行了性能测定，证明效果尚佳，现将方法介绍如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料来源

    1.1.1  基础培养基  双糖铁琼脂培养基（上、下层），购于杭州微生物试剂厂。三糖铁琼脂，购于杭州微生物试剂厂。尿素；KH2PO4均购于西安化学试剂厂。

    1.1.2  待检菌株  志贺菌 (1.1869)；由GGMCC提供，沙门菌（1.1174）；由GGMCC提供，地方株：宋内志贺菌株，菌号：05002；伤寒沙门菌株，菌号：04010；肠炎沙门菌株，菌号：05007；大肠埃希菌（ETEC O78:K80，）菌号：05008；普通变形杆菌，菌号：07016；弗劳地枸橼酸杆菌，菌号：040011，以上菌株均由本室保存。

    1.1.3  诊断血清  志贺菌属诊断血清（48种）；沙门菌属诊断血清（59种）；肠致病性大肠埃希菌诊断血清（15种）以上各属血清均由卫生部兰州生物制品研究所提供。肠侵袭性、产毒性大肠埃希菌诊断血清（16种）由卫生部成都生物制品研究所提供。以上各属血清均在有效期限内使用。

    1.2  方法

    1.2.1  三糖铁尿素培养基的配制  配制培养基用华氏小试管应清洗干净后加塞包装好，经15 Pa 20min高压灭菌后备用。将成品双糖铁琼脂培养基按说明分别称量配制上、下层后混匀，将已配好的上层培养基内加入1%的蔗糖，稍加温溶解混匀后分装于适量的小三角烧瓶内高压备用。再按2%尿素、0.2% KH2PO4的量加入已称量配好的下层培养基内，稍加温后混匀待温度冷却后用NaOH校正pH至7.0。将配好的该培养基下层分装于已高压灭菌好的华氏小试管中约1.5～2ml直立包装。再与上层培养基一同经10Pa 10min高压灭菌后置冰箱保存备用。

    试验前可将配制好的上层培养基溶解后，以无菌操作下分装于已配制好并高压灭菌的下层培养基管中2～2.5ml制成斜面备用。此时的培养基即为三糖铁尿素半固体斜面培养基。

    1.2.2  样品接种   将待检目的菌进行复活后，分别划种于S.S琼脂平板上置37℃温箱培养18～24h，再取配制好的三糖铁尿素半固体斜面培养基注明菌号后，挑取经S.S琼脂平板上培养后的典型菌落，分别穿刺接种于上述培养基内，置37℃温箱培养18～24h后观察结果，各待检菌的初步生化反应结果见表1。 表1  不同菌株在三糖铁尿素斜面上的反应 注：（1） K为红色；  A为黄色；  ＋为阳性；  -为阴性；  +/- 大多时为阳性，少时为阴性；-/+ 少时为阴性，大多时为阳性；  (-) 多时为阴性；   (+) 多时为阳性；  D为不定。

    1.2.3  配制时应注意点  尿素酶极受温度影响,高压时温度过高过久，都有可能使尿素酶分解，如加热不足，又可造成灭菌不彻底，所以准确的把握灭菌温度及加热时间是关键。

    加入适量的KH2PO4后，能阻止尿素在灭菌过程中产生的氨与二氧化碳联结为氨基甲酸铵，同时KH2PO4还可起到缓冲作用，如果温度掌握适中可使下层培养基pH保持在7.0～7.1，加入KH2PO4后，可发挥尿素酶的最大活力，易于尿素酶阳性菌的结果观察。

    我们将改进后的培养基经过实验后的反应归纳有以下几种：斜面不变色、底层变黄色，不产气、无动力，硫化氢阴性，不分解尿素酶者可考虑为志贺菌属细菌；

    斜面不变色、底层产酸产气、产生硫化氢，不分解尿素酶者可考虑为沙门菌属细菌；

    斜面不变色，底层产酸不产气，尿素酶阴性、可产生少量硫化氢者可考虑伤寒沙门菌；

    斜面和底层均变红色，有动力，产或不产气，硫化氢阳性或阴性，尿素酶阳性者可考虑为变形杆菌属细菌。

    根据以上各生化反应，能初步判断所属的属或种，然后再以血清学试验加以证实确定属或种，同时还可以从以上生化试验中判定出无诊断血清的其它菌属［1］。

    3  讨论

    细菌检验需要经过分离、培养、繁殖、动态观察以及生化特性的不固定变化等因素综合判定并认真鉴定后才能拿到确定的菌株，与其他检验医学方面最大的不同也在于此, 至今仍离不开传统的手工操作。改进后的三糖铁尿素半固体斜面培养基与其他肠杆菌科培养基最大的优点是易于观察尿素酶的结果，可以不做其他辅助生化。在一支培养基中，同时观察多种生化反应和生长情况，可以防止尿素酶阳性的细菌漏检。用于肠道菌检查用的单糖，双糖、三糖、四糖等培养基配制方法很多［2］，但由于配制耗时和基层实验室在配制中的诸多问题，以致在许多基层实验室不能正常使用。市场上出售的双糖铁（kligler）和三糖铁（TS1）琼脂培养基干粉成品［3］，虽已广泛用于肠道细菌的检验工作，但均不含尿素成份。如果检验尿素酶阳性的细菌须另做单独的尿素管，改进后的培养基就可以减少繁琐的单管试验方法。该培养基的配制方法简便易行、省时省力，不需要任何高端技术和仪器，适用于各类实验室，尤其适用于基层腹泻病门诊实验室工作。

    我们推荐使用的该培养基经过同行多年的工作实践总结，已在当地推荐并长期使用，效果很好。我们相信该培养基在传统的微生物分离技术上会给同行带来方便，我们愿与同行共享。

【参考文献】
  1 P. R爱德华，W．H． 爱文. 肠杆菌科的鉴定.卫生部药品生物制品检定所.江西省卫生防疫站，第3版，1997：92.

2 陈夫元，刘捷.细菌培养基. 北京：中国科学技术出版社， 1992,149-156.

3 扳琦利一．他． 新细菌培地讲座（第二版）下1. 东京:近代出版社，1993,180.

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